鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在壓力超負(fù)荷致左室舒張功能不全中的作用機(jī)制研究.pdf

1、前言
　　舒張性心力衰竭（也稱射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭）是目前基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)，因其在發(fā)病機(jī)理和臨床特點(diǎn)等方面有別于收縮性心力衰竭，好發(fā)于伴有高血壓、糖尿病的人群及老年女性人群。而左室舒張功能不全是舒張性心力衰竭的最早期表現(xiàn)，其特點(diǎn)為心室舒張延遲和/或順應(yīng)性減低。關(guān)于正常心臟如何在損傷因子作用下發(fā)展到舒張功能不全以及如何由舒張功能不全進(jìn)展到舒張性心力衰竭，目前研究較少，一方面是由于缺乏公認(rèn)的舒張功能不全的動(dòng)物模型，另一方面也在于

2、舒張性心力衰竭的概念近年才受到重視。和收縮性心力衰竭的治療能夠有效逆轉(zhuǎn)和/或延緩左室重構(gòu)不同，舒張性心力衰竭的處理目前主要以治療和糾正原發(fā)病為主（2012年歐洲急慢性心力衰竭治療指南），拮抗神經(jīng)內(nèi)分泌激活在收縮性心力衰竭患者能顯著降低心衰住院率和死亡率，而在舒張性心力衰竭患者目前尚沒有臨床研究證實(shí)其效益。
　　鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)及其信號(hào)通路被證實(shí)在高血壓心肌肥厚的病理性心臟重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用，而高

3、血壓也是引起舒張功能不全和舒張性心力衰竭最常見的原因。那么鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號(hào)通路在壓力超負(fù)荷條件下對(duì)在心臟重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用的心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞的作用機(jī)制如何還未完全明確。
　　筆者進(jìn)行了一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果顯示舒張性心力衰竭患者長(zhǎng)期應(yīng)用ACEI類藥物可以降低全因死亡率，卻未能降低心衰死亡率和全因再入院率，因此，對(duì)于舒張性心力衰竭尤其是早期舒張功能不全的識(shí)別和機(jī)制研究，有助于對(duì)此類患者的早期干預(yù)和改善預(yù)后。本研究首先擬選擇舒

4、張功能不全的代表性動(dòng)物模型，進(jìn)行評(píng)價(jià)，然后從分子機(jī)制水平，以心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞為主要研究對(duì)象以期初步闡明鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在壓力超負(fù)荷致左室舒張功能不全中的作用，最后通過動(dòng)物水平藥物干預(yù)的效果和機(jī)制探討，從而明確鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在壓力超負(fù)荷引起的左室舒張功能障礙過程中的作用機(jī)理，為臨床預(yù)防和治療左室舒張功能不全和舒張性心力衰竭提供理論依據(jù)和干預(yù)靶點(diǎn)。
　　第一部分壓力超負(fù)荷致左室舒張功能不全動(dòng)物模型的觀察和評(píng)價(jià)
　　目的:采

5、用超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)自發(fā)性高血壓大鼠左室舒張功能變化。
　　方法:3月齡雄性SHR和Wistar大鼠各15只，觀察時(shí)間點(diǎn)分別為3月齡、6月齡和9月齡（n均等于5）。采用17.5 MHz小動(dòng)物高頻超聲探頭，通過M型超聲、二尖瓣口血流頻譜多普勒和二尖瓣環(huán)組織多普勒技術(shù)，評(píng)價(jià)兩組大鼠心臟結(jié)構(gòu)與舒張功能各項(xiàng)指標(biāo)變化，并檢測(cè)血清NT-proBNP水平以及通過組織病理學(xué)觀察兩組大鼠心臟病理改變。
　　結(jié)果:和Wistar大鼠相比，3月齡SH

6、R收縮壓明顯升高（168.0±4.5 mmHg vs105.8±8.4 mmHg，P＜0.01），血清NT-proBNP水平高于同月齡Wistar大鼠(284.38±6.54 fmol/ml vs190.77±15.47 fmol/ml，P＜0.01)，超聲顯示SHR室間隔厚度(IVS)、左室后壁厚度(LVPW)均大于Wistar大鼠(IVS:1.58±0.08 mmvs1.16±0.13 mm, P＜0.01; LVPW:1.65±0

7、.08 mm vs1.39±0.18 mm, P＜0.01),E/E'升高（26.28±1.76 vs18.85±3.69，P＜0.01）;6月齡和9月齡SHR E/A、E'/A'均小于同月齡Wistar大鼠值（6月齡E/A:2.05±0.23 vs2.78±0.14，E'/A':0.57±0.06vs1.46±0.10;9月齡E/A:1.92±0.13 vs2.67±0.31;E'/A':0.61±0.07 vs1.44±0.11;所

8、有P＜0.05），NT-proBNP水平均高于Wistar大鼠值（6月齡:333.40±13.42fmol/ml vs191.42±8.25 fmol/ml;9月齡:354.31±9.39 fmol/ml vs190.36±9.13fmol/ml;所有P＜0.01），E/E'均大于同月齡Wistar大鼠值（6月齡:30.85±1.35 vs21.08±1.64;9月齡:31.77±5.22 vs21.54±2.11，所有P＜0.01）;

9、減速時(shí)間(DT)、等容舒張時(shí)間(IVRT)兩組大鼠比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6月齡和9月齡SHRE/A、E'/A'均小于3月齡SHR值(P＜0.05);E/E'均大于3月齡SHR值(P＜0.05);DT、IVRT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同月齡Wistar大鼠各項(xiàng)舒張功能超聲指標(biāo)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SHR和Wistar大鼠隨月齡增大收縮功能變化差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。心肌組織HE染色顯示，和Wistar大鼠相比，隨SHR月齡增大，心肌細(xì)胞進(jìn)行性

10、肥大;Masson染色觀察膠原含量變化表明隨著舒張功能進(jìn)行性受損，SHR心肌間質(zhì)及血管周圍膠原顯著增多。
　　結(jié)論:6月齡自發(fā)性高血壓大鼠出現(xiàn)舒張功能異常，組織學(xué)主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大和間質(zhì)及血管周圍纖維化，高頻超聲是評(píng)價(jià)心臟結(jié)構(gòu)和舒張功能的良好手段。
　　第二部分鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在牽張的心肌細(xì)胞肥厚和凋亡中的作用探討
　　目的:明確鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶對(duì)牽張后的心肌細(xì)胞肥厚和凋亡的影響及作用機(jī)制。
　　方法:酶消化+差

11、速貼壁的方法培養(yǎng)SD乳鼠原代心肌細(xì)胞，機(jī)械牽張模擬壓力超負(fù)荷條件，將培養(yǎng)的細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、機(jī)械牽張組、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶siRNA+機(jī)械牽張組、FK506+機(jī)械牽張組、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶過表達(dá)+機(jī)械牽張組。收集細(xì)胞提取總蛋白和mRNA檢測(cè)細(xì)胞肥大(ANP、SAA)和凋亡(Bax/Bcl-2)相關(guān)指標(biāo)表達(dá)及活性改變。
　　結(jié)果:鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶干擾和過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染效果確定。和對(duì)照組相比，單純牽張導(dǎo)致明顯的細(xì)胞肥大和凋亡增加

12、，過表達(dá)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶后產(chǎn)生和牽張類似的效應(yīng)，而鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶干擾以及FK506抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性后以上負(fù)性作用明顯減輕，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶干擾的改善作用更明顯。伴隨鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性的上調(diào)/下調(diào)，其下游信號(hào)分子NFAT3對(duì)應(yīng)表達(dá)上調(diào)/下調(diào)。結(jié)論:鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶參與了機(jī)械牽張模擬壓力超負(fù)荷條件刺激下的心肌細(xì)胞肥大和凋亡過程，阻斷Calcineurin/NFAT3信號(hào)通路可以逆轉(zhuǎn)心肌肥大和減輕細(xì)胞凋亡。
　　第三部分鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在

13、牽張心臟成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)分化和凋亡中的作用機(jī)制探討
　　目的:明確鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶對(duì)牽張后的心臟成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)分化和凋亡的影響及作用機(jī)制。
　　方法:酶消化法培養(yǎng)SD乳鼠原代心臟成纖維細(xì)胞，消化傳代取P2～P3代細(xì)胞，機(jī)械牽張模擬壓力超負(fù)荷條件，將培養(yǎng)的細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、機(jī)械牽張組、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶siRNA+機(jī)械牽張組、FK506+機(jī)械牽張組、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶過表達(dá)+機(jī)械牽張組。采用CCK-8法和WB檢測(cè)細(xì)胞增殖(PCN

14、A)、WB檢測(cè)轉(zhuǎn)分化(α-SMA)和凋亡（Bax/Bcl-2）相關(guān)指標(biāo)的變化。同時(shí)通過TGF-β1刺激培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞，探討鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路在增殖和轉(zhuǎn)分化中所發(fā)揮的作用。
　　結(jié)果:CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)和免疫印跡檢測(cè)PCNA結(jié)果顯示，和對(duì)照組相比，單純牽張引起顯著的成纖維細(xì)胞過度增殖，過表達(dá)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶后產(chǎn)生和牽張類似的效應(yīng)，同時(shí)，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號(hào)通路的激活促使心臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和凋亡增加，而鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶干擾后心臟

15、成纖維細(xì)胞增殖被抑制，轉(zhuǎn)分化和凋亡減少。不同的是，F(xiàn)K506抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性后心臟成纖維細(xì)胞增殖和凋亡有所減輕，轉(zhuǎn)分化未見明顯減少。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，TGF-β1刺激后的心臟成纖維細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)分化增加伴隨有Calcineurin/NFAT3信號(hào)通路的激活。
　　結(jié)論:鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶參與了機(jī)械牽張模擬壓力超負(fù)荷條件刺激下的心臟成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)分化和凋亡過程，阻斷Calcineurin/NFAT3信號(hào)通路可以逆轉(zhuǎn)以上負(fù)性重構(gòu)過程。

16、
　　第四部分奧美沙坦通過抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)左室舒張功能不全的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:探討奧美沙坦能否通過下調(diào)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號(hào)通路而逆轉(zhuǎn)左室舒張功能不全。
　　方法:采用已經(jīng)明確出現(xiàn)舒張功能不全的6月齡SHR，隨機(jī)分為SHR+saline組和SHR+olmesartan組（n均等于12），同時(shí)以6月齡Wistar大鼠+saline作為對(duì)照組，相應(yīng)給予10 ml/kg/d的生理鹽水或者2.5 mg/kg/d的奧

17、美沙坦灌胃3個(gè)月。于基線情況下及干預(yù)后超聲檢測(cè)心臟舒張功能，心臟組織HE染色和Realtime PCR觀察心肌肥厚變化，Masson三色染色觀察心肌間質(zhì)膠原沉積，免疫印跡觀察鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/NFAT3信號(hào)通路蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:舒張功能不全伴隨鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號(hào)通路的過度激活，而奧美沙坦能夠下調(diào)該病理性信號(hào)通路。
　　結(jié)論:奧美沙坦通過下調(diào)Calcineurin/NFAT3信號(hào)通路而起到改善壓力超負(fù)荷致左室舒張功能不全