MED19對(duì)肝癌細(xì)胞惡性增殖和腫瘤形成的影響.pdf

1、第一部分、慢病毒介導(dǎo)MED19 shRNA載體構(gòu)建
　　 目的:構(gòu)建MED19的shRNA重組慢病毒載體,并包裝慢病毒顆粒。
　　 方法:使用Ambion公司的RNA干擾引物設(shè)計(jì)軟件對(duì)MED19靶點(diǎn)序列進(jìn)行設(shè)計(jì);將設(shè)計(jì)的序列進(jìn)行合成載體構(gòu)建;挑選陽(yáng)性和測(cè)序正確的質(zhì)粒進(jìn)行病毒包裝;將包裝的慢病毒感染人肝癌細(xì)胞,并用qPCR和Western blotting的方法驗(yàn)證人肝癌細(xì)胞內(nèi)MED19的基因是否被沉默。
　　 結(jié)

2、果:MED19 shRNA重組慢病毒載體構(gòu)建成功,qPCR和Western blotting結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的第一條靶點(diǎn)序列在人肝癌細(xì)胞HepG2和Hep3B細(xì)胞內(nèi)沉默表達(dá)MED19的效果良好,敲減效率達(dá)到80％以上。
　　 結(jié)論:MED19的shRNA重組慢病毒載體構(gòu)建和慢病毒包裝成功。
　　 第二部分、沉默MED19表達(dá)對(duì)人肝癌細(xì)胞的生物學(xué)影響
　　 目的:探討沉默MED19表達(dá)對(duì)人肝癌細(xì)胞的生物學(xué)影響。<

3、br>　　 方法:設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組:用MED19 shRNA重組慢病毒感染人肝癌細(xì)胞,用MTT的方法檢測(cè)MED19沉默表達(dá)后,人肝癌細(xì)胞的增殖能力的變化;用BrdU的方法檢測(cè)下調(diào)MED19表達(dá)后,人肝癌細(xì)胞DNA合成速度;用克隆形成的方法驗(yàn)證MED19敲減后,人肝癌細(xì)胞的克隆形成能力變化;采用流式檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞周期,觀察各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的周期情況。建立人肝癌移植小鼠模型,研究MED19基因沉默對(duì)人肝癌細(xì)胞成瘤能力的影響。
　　 結(jié)果

4、:重組的MED19 shRNAl慢病毒載體作用人肝癌細(xì)胞HepG2和Hep3B細(xì)胞后,下調(diào)MED19表達(dá),HepG2細(xì)胞和Hep3B細(xì)胞的增殖能力被顯著抑制,這兩株細(xì)胞的DNA復(fù)制水平也顯著降低,并且抑制細(xì)胞的克隆形成能力,MED19基因被敲減后細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期。體內(nèi)研究結(jié)果表明,MED19沉默導(dǎo)致Hep3B肝癌細(xì)胞的成瘤能力顯著降低。
　　 結(jié)論:MED19對(duì)肝癌細(xì)胞異常增殖具有重要的調(diào)節(jié)作用,MED19 shRN