突變HBV X對肝癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 全球乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者約為20億人，其中慢性感染者已超過3.5億人。原發(fā)性肝癌是全世界常見的惡性腫瘤，HBV感染的慢性化被認(rèn)為是主要的致病因素，但其致癌的具體機(jī)制尚不完全清楚。
　　 乙型肝炎病毒X基因編碼的X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是一種多功能病毒調(diào)節(jié)蛋白，具有廣泛的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，是HBV感染和復(fù)制過程中必

2、須的多功能病毒蛋白質(zhì)，并可能直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌變。
　　 研究表明細(xì)胞癌變與細(xì)胞周期失控密切相關(guān)，典型的細(xì)胞周期包括有嚴(yán)格順序的5個(gè)期即G0(靜止期)-G1期(合成前期)-S(合成期)-G2期(合成后期)-M期(分裂期)。細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的核心是一組細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDKs)，受細(xì)胞周期素(cyclin)及其抑制蛋白的正負(fù)調(diào)節(jié)。其中CDK4/6與cyclin D1、D2、D3結(jié)合是G1期運(yùn)行的必要條件。
　　 Rb

3、是第一個(gè)被克隆的抑癌基因，參與和調(diào)節(jié)細(xì)胞由G1向S期過渡。Rb的磷酸化狀態(tài)是其調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化的主要形式，Rb在非磷酸化狀態(tài)時(shí)可與E2F蛋白結(jié)合，并抑制其活化基因表達(dá)的功能，當(dāng)處于磷酸化時(shí)則不能與E2F結(jié)合，而E2F與DP1蛋白形成的二聚體在細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期過程中起了關(guān)健作用。
　　 P16亦為抑癌基因，屬于周期依賴性激酶抑制因子(CDKI)基因家族，編碼的p16蛋白為CDK4/6抑制劑，與CDK4/6有高度親和性，在細(xì)胞增

4、殖調(diào)控中與cyclin D1競爭同CDK4/6結(jié)合，對細(xì)胞周期發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。通過阻止細(xì)胞周期通過G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與調(diào)亡、阻止有DNA損傷的細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖中起到關(guān)鍵的作用，它的失活可導(dǎo)致細(xì)胞周期縮短，生長加快，從而誘發(fā)腫瘤。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌患者的癌組織和血清標(biāo)本中，可同時(shí)檢測到野生型和突變型的HBV X基因，對比HBV相關(guān)HCC和HBV相關(guān)肝病患者血清和肝組織標(biāo)本后發(fā)現(xiàn)，在HBV相關(guān)HCC中，突變型HB

5、V X檢出率更高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)整合到肝細(xì)胞基因組的HBV X比未整合的HBV X突變機(jī)率高得多。據(jù)此有人推測突變型HBV X可能有其不同的生物學(xué)功能，突變型HBV X可能是腫瘤的早期事件和選擇的結(jié)果。
　　 研究目的：
　　 1、明確氨基端或羧基端缺失突變50個(gè)氨基酸的HBx對肝癌細(xì)胞增殖的影響及可能機(jī)制。
　　 2、探討HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的可能功能域。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 采用PCR法擴(kuò)增氨

6、基端或羧基端缺失50個(gè)氨基酸的HBx基因片段(HBxn、HBxc)，并定向插入綠色熒光蛋白(GFP)真核表達(dá)載體pEGFP-C1的HindⅢ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)，并用HindⅢ、KpnⅠ雙酶切及測序鑒定已構(gòu)建重組體pGFP-HBxn及pGFP-HBxc。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組體pEGFP-HBxn、pGFP-HBxc轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，用G418篩選抗性細(xì)胞克隆，在熒光顯微鏡下觀察GFP-HBxn、GFP-HBxc融合蛋白的表達(dá)。RT-P

7、CR鑒定HBxn、HBxc基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，建立穩(wěn)定表達(dá)GFP-HBxn、GFP-HBxc融合蛋白的HepG2細(xì)胞系(HepG2/GFP-HBxn、HepG2/GFP-HBxc)。以HepG2/GFP-HBxn、HepG2/GFP-HBxc及本室保存的HepG2、HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx細(xì)胞作為本實(shí)驗(yàn)體系。MTT法檢測上述細(xì)胞的細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，Western blot法檢測p16、總Rb、pRb7

8、95的表達(dá)。根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 經(jīng)雙酶切及測序鑒定表明成功構(gòu)建了GFP與氨基端或羧基端缺失50個(gè)氨基酸的HBx重組表達(dá)載體pGFP-HBxn、pGFP-HBxc。將pGFP-HBxn、pGFP-HBxc，分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得抗性細(xì)胞克隆，在熒光顯微鏡下見部分抗性克隆細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)的

9、GFP熒光蛋白。將帶綠色熒光蛋白的抗性克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并傳代，細(xì)胞仍表達(dá)強(qiáng)的熒光蛋白，RT-PCR檢測示HepG2/GFP-HBxn、HepG2/GFP-HBxc細(xì)胞分別有HBxn、HBxc的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。MTT檢測示HepG2/GFP-HBx、HepG2/GFP-HBxc細(xì)胞的增殖速度明顯快于HepG2、HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBxn細(xì)胞。(p＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測示HepG2/GFP-HBx(51.043±3.

10、628)％、HepG2/GFP-HBxc(48.143±3.721)％細(xì)胞的G0/G1期百分比較HepG2(65.767±1.665)％、HepG2/GFP(65.193±2.952)％細(xì)胞明顯減少(P＜0.05)，然而HepG2/GFP-HBxn(67.950±2.128)％細(xì)胞同HepG2、HepG2/GFP細(xì)胞比較無明顯差異。Western blots檢測結(jié)果顯示HepG2/GFP-HBx、HepG2/GFP-HBxc細(xì)胞的p16

11、、Rb表達(dá)量明顯低于HepG2、HepG2/GFP細(xì)胞，然而pRb795表達(dá)水平則高于HepG2、HepG2/GFP細(xì)胞。HepG2/GFP-HBxn細(xì)胞p16、Rb、pRb795的表達(dá)水平同HepG2、HepG2/GFP細(xì)胞無差異。
　　 結(jié)論：
　　 1、HBx與羧基端缺失突變50個(gè)氨基酸的HBx均能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。
　　 2、HBx與HBxc可能是通過抑制抑癌基因p16、Rb的表達(dá)及促進(jìn)Rb的磷酸化從而