以MRSA多重耐藥蛋白PBP2a為靶點從中藥中尋找抗菌增敏劑的實驗研究.pdf

1、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)是醫(yī)院感染的重要病原菌，也是引起燒傷、嚴重創(chuàng)傷后感染的最常見致病菌之一。在金黃色葡萄球菌感染中，MRSA所致的醫(yī)院感染越來越流行，尤其在ICU、燒傷病房等，MRSA的檢出率都有明顯增高趨勢，最高可達90％以上，給臨床治療護理工作帶來了極大的困難。其中，老年患者、危重病患者、免疫功能低下者及新生兒等是MRSA感染的高危人

2、群；長期使用抗生素，侵入性操作以及消毒隔離措施等醫(yī)源性因素均可導(dǎo)致MRSA感染率增加。 MRSA的耐藥機制主要與其mecA基因大量表達產(chǎn)生的一種特殊青霉素結(jié)合蛋白PBP2a有關(guān)，該蛋白由668個氨基酸組成，分子量為76.1kDa，對所有β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力低。水溶性的PBP2a為去除N-末端23個氨基酸后的蛋白質(zhì)(不影響PBP2a與β-內(nèi)酰胺類抗生素的結(jié)合)，含有兩個功能域：N-末端非青霉素結(jié)合域(24～326aa)，負責蛋

3、白的延伸和錨定；C-末端功能域(327～668aa)，具有轉(zhuǎn)肽酶活性和β-內(nèi)酰胺酶的作用。當β-內(nèi)酰胺類抗生素抑制了由敏感金葡菌產(chǎn)生的PBPs時，PBP2a可以替代其轉(zhuǎn)肽酶功能，繼續(xù)維持細菌細胞壁的合成，表現(xiàn)出耐藥性。 MRSA臨床分離株大多是多重耐藥，僅對糖肽類抗生素如萬古霉素敏感。然而，隨著其廣泛應(yīng)用，已出現(xiàn)一些耐萬古霉素金黃色葡萄球菌的報道。1996年在日本分離到萬古霉素中度敏感的MRSA，隨后2002年在美國發(fā)現(xiàn)了萬古霉

4、素耐藥的MRSA，至今尚無其它治療MRSA感染的有效藥物。所以，更新研究策略、尋找新的藥物來抑制PBP2a的活性，恢復(fù)MRSA對抗生素的敏感性或降低MRSA耐藥性具有十分重要的臨床意義。 目的： 本研究基于PBP2a在MRSA耐藥機制中的重要性，擬從MRSA臨床分離株中獲得多重耐藥蛋白PBP2a，以此為靶點應(yīng)用生物傳感器技術(shù)篩選具有與PBP2a高結(jié)合力的中藥，從中藥中尋找抗菌增敏劑，恢復(fù)抗生素的敏感性，為MRSA感染的防

5、治研究提供新的策略。 方法： 1.可溶性重組蛋白PBP2a的表達、純化與鑒定：采用PCR方法從MRSA臨床分離株中擴增編碼PBP2a可溶性全片段的mecA基因(76-2007bp)，構(gòu)建原核表達載體pQE30-mecA，經(jīng)酶切鑒定后進行DNA測序：將pQE30-mecA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌M15并誘導(dǎo)表達PBP2a可溶性全片段，對重組蛋白PBP2a進行Ni2+親和層析純化后，測定其純度；并進行氨基酸測序與分子量鑒定。然后，對P

6、BP2a的生物學(xué)活性與結(jié)合活性進行評價。采用分光光度法對PBP2a分別進行轉(zhuǎn)肽酶及β-內(nèi)酰胺酶活性測定，并通過二倍微孔稀釋法與激光共聚焦技術(shù)觀察PBP2a與抗生素的體外結(jié)合作用。 2.以PBP2a為靶點篩選拮抗MRSA的中藥：將PBP2a包被于生物傳感器的樣品池作為固相配基，通過對26種中藥水煎液與PBP2a結(jié)合活性的測定，選擇結(jié)合力較高的10種中藥，再結(jié)合直接抗菌實驗，以及10種中藥與苯唑西林的聯(lián)合抗菌實驗，篩選出對MRSA具

7、有抗菌增敏作用的中藥。 3.夏枯草中對MRsA抗菌增敏組分的分離提取及活性評價：首先通過生物傳感器測定夏枯草不同部位水煎液與PBP2a的結(jié)合活性，再經(jīng)聯(lián)合抗菌實驗對它們的抗菌效果進行初步測定；利用AB-8大孔吸附樹脂分離富集夏枯草全草水煎液中的有效組分，追蹤檢測其與PBP2a的結(jié)合力，通過抗菌實驗與聯(lián)合抗菌實驗確定抗菌增敏組分，并對其物質(zhì)屬性進行鑒定；觀察其與苯唑西林聯(lián)用的抑菌曲線、與β-內(nèi)酰胺類抗生素的聯(lián)合抗菌作用，然后通過透

8、射電鏡觀察其對MRSA細菌形態(tài)的影響，評價可能的抗菌作用機制。 結(jié)果： 1.成功擴增出mecA基因片段(76～2007bp)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pQE30-mecA，基因序列分析表明，mecA基因片段的大小與預(yù)期一致，但序列中出現(xiàn)了9個堿基突變，所編碼蛋白質(zhì)與GenBank收錄的蛋白質(zhì)同源性為96％；在大腸桿菌M15中實現(xiàn)了可溶性PBP2a的高效表達，經(jīng)分離純化后得到的重組蛋白PBP2a純度達到90.6％；蛋白質(zhì)N端15個氨

9、基酸測序結(jié)果為：MRGSHHHHHHGSKDK，與預(yù)期一致；質(zhì)譜分析其相對分子質(zhì)量約為74kDa，與預(yù)期相符；所獲得的重組蛋白PBP2a具有轉(zhuǎn)肽酶活性與β-內(nèi)酰胺酶活性，并且在體外與β-內(nèi)酰胺類抗生素具有一定的結(jié)合活性。 2.成功地將PBP2a包被于生物傳感器的羧甲基葡聚糖樣品池上，從26種中藥中篩選了10種與PBP2a有較高結(jié)合力的中藥；體外抗菌實驗顯示，黃芩、夏枯草、黃連對MRSA的單獨抗菌效果較好；10種中藥與苯唑西林的聯(lián)

10、合抗菌實驗顯示，夏枯草與苯唑西林的聯(lián)合抗菌效果最好。 3.夏枯草的全草與果穗中均含有與PBP2a具較高結(jié)合力的活性成分，其抗菌效果差別不明顯；夏枯草全草水煎液經(jīng)過AB-8大孔吸附樹脂分離富集，得到SP2組分；SP2組分不僅與PBP2a具有較高的結(jié)合力，而且與苯唑西林聯(lián)用能夠明顯抑制MRSA的生長速度；可以使苯唑西林、青霉素、舒氨西林、氨芐西林對MRSA的MIC分別降低256、8、16及4倍，SP2與苯唑西林、青霉素、舒氨西林、氨

11、芐西林的FIC分別為0.007、0.151、0.064、0.276；SP2能夠通過破壞MRSA的細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)揮抗菌增敏作用；SP2為水溶性組分，含有大量的酚羥基類物質(zhì)，其有效成分的分子量范圍大約為3～5kDa。 結(jié)論： 采用基因重組技術(shù)，成功實現(xiàn)了MRSA臨床分離株中可溶性PBP2a的高效表達；以多重耐藥蛋白PBP2a為靶點，應(yīng)用生物傳感器建立了篩選拮抗MRSA中藥的技術(shù)平臺。利用該平臺，我們從26種中藥中篩選出與PBP