以XIAP基因?yàn)榘悬c(diǎn)逆轉(zhuǎn)卵巢癌多藥耐藥的研究.pdf

1、研究背景：
　　目前對(duì)卵巢癌的治療原則是以手術(shù)為主，輔以化療等綜合治療。隨著有效化療方案廣泛應(yīng)用，卵巢惡性生殖細(xì)胞腫瘤的治療效果有了明顯提高，死亡率由90％降至10％，但卵巢上皮癌的治療效果確一直未獲根本改善，5年生存率徘徊于30％～40％。因此，卵巢癌的診治仍面臨許多困難和挑戰(zhàn)，伴隨臨床標(biāo)準(zhǔn)化化療而來的腫瘤細(xì)胞的原發(fā)性和/或繼發(fā)性耐藥已成為影響卵巢癌臨床治療效果的重要障礙。70％的卵巢癌患者在治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā),關(guān)鍵原因之一是卵巢癌

2、細(xì)胞對(duì)鉑類化療藥物產(chǎn)生耐藥。卵巢癌對(duì)鉑類藥物的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，涉及藥物蓄積、代謝、凋亡、DNA損傷修復(fù)等多方面，尚難以定論哪一個(gè)方面占主要地位，且許多機(jī)制仍不清楚。許多已知和未知的因素參與癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的過程從而為耐藥性的逆轉(zhuǎn)帶來困難。因此了解卵巢腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的機(jī)制以及各種細(xì)胞生物學(xué)指標(biāo)在耐藥產(chǎn)生中所起的作用十分重要，可以指導(dǎo)我們更為合理的選擇相應(yīng)的化療方案，并選擇相應(yīng)的特異的耐藥修飾劑，可不同程度改善卵巢癌的預(yù)后。隨著生命科學(xué)

3、的飛速發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)的不斷改進(jìn)，從基因水平去研究耐藥機(jī)制已成為人類腫瘤研究的熱點(diǎn)。積極尋找新的卵巢癌防治手段，進(jìn)一步提高卵巢癌的總體治療水平，在我國(guó)將具有積極而重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein,IAPs)是一類在結(jié)構(gòu)上具有同源性的細(xì)胞內(nèi)源性凋亡抑制蛋白家族。人類IAPs的主要成員X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linkedinhibitorofapoptosisprotein

4、,XIAP)是IAP家族中最有效力的caspase抑制物,也是分子結(jié)構(gòu)研究得最清楚的IAP家族成員。研究發(fā)現(xiàn)XIAP的生物學(xué)功能多樣，對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有多方面的影響，XIAP對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分裂周期有雙重調(diào)控作用，具有選擇性的組織細(xì)胞分布特征以及特殊的抑制細(xì)胞凋亡的作用機(jī)理，可能成為腫瘤診斷的標(biāo)志物以及腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)。學(xué)者們對(duì)XIAP在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用和靶向治療中的應(yīng)用等研究正逐步深入。本課題將利用腺病毒載體介導(dǎo)siRN

5、A片段抑制XIAP基因的表達(dá)，進(jìn)一步闡明卵巢癌多藥耐藥的可能機(jī)制，為卵巢癌的基因治療提供一個(gè)新的可能的靶點(diǎn)及相關(guān)理論依據(jù)，為卵巢腫瘤的治療開辟更廣闊的路徑。
　　目的：
　　利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，以XIAP基因?yàn)榘谢?，以卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞A2780/DDP為靶細(xì)胞，設(shè)計(jì)構(gòu)建針對(duì)XIAP基因的siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序鑒定及干涉效率的評(píng)價(jià)，利用腺病毒載體系統(tǒng)介導(dǎo)RNA干涉片段轉(zhuǎn)染卵巢癌耐藥細(xì)胞，獲得XIAP基

6、因表達(dá)抑制細(xì)胞，并檢測(cè)該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780/DDP后XIAP基因表達(dá)情況、卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為以及多藥耐藥特性的影響，并結(jié)合基因芯片技術(shù)對(duì)其可能機(jī)制及作用通路進(jìn)行初步研究。將有望發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)上皮性卵巢癌多藥耐藥的新途徑，為卵巢癌的基因治療提供新的技術(shù)方案和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.干擾質(zhì)粒psiRNA－XIAP的構(gòu)建、篩選及鑒定
　?、賡iRNA靶序列的選擇及其模板DNA的設(shè)計(jì)：利用GeneBank得

7、到XIAP的mRNA序列，根據(jù)siRNA靶序列遴選設(shè)計(jì)原則，并經(jīng)BLAST序列同源性分析后，選擇三條特異性siRNA靶序列，進(jìn)而設(shè)計(jì)、合成其相應(yīng)的模板DNA；
　　②干擾質(zhì)粒psiRNA－XIAP的構(gòu)建、篩選及鑒定：磷酸化各單鏈DNA片段之5’末端，退火產(chǎn)生相應(yīng)的雙鏈DNA，分別插入BglⅠ和HindⅢ雙酶切空白質(zhì)粒pSilencer，得到干擾質(zhì)粒psiRNA－XIAP1、2、3，分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑選陽(yáng)性菌落，裂解法小量抽

8、提質(zhì)粒DNA，BglⅠ和HindⅢ雙酶切，1％瓊酯糖凝膠電泳初步鑒定后進(jìn)行測(cè)序；
　?、酆Y選XIAPmRNA敲除效率最佳的干擾質(zhì)粒：中量提取各干擾質(zhì)粒psiRNA－XIAP1、2、3，輔以脂質(zhì)體Lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞系A(chǔ)2780/DDP，對(duì)照組為空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組。24h后，RT-PCR、Westernblot檢測(cè)各組A2780/DDP細(xì)胞的XIAP表達(dá)水平，據(jù)此選擇干擾效果最佳的的干

9、擾質(zhì)粒以構(gòu)建重組腺病毒pAd-siRNA-XIAP；
　　2.重組腺病毒pAd-siRNA-XIAP的構(gòu)建、鑒定、包裝及滴度的測(cè)定：XbalⅠ和XholⅠ雙酶切干擾質(zhì)粒psiRNA-XIAP得到siRNA-XIAP表達(dá)片段，插入XbalⅠ和XholⅠ雙酶切的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack，得到pAdTrack-siRNA-XIAP，PmeⅠ酶切線性化后，轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183，二者同源重組產(chǎn)

10、生重組腺病毒質(zhì)粒pAd-siRNA-XIAP?？敲顾乜剐院Y選，挑取陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒pAd-siRNA-XIAP，BamHⅠ酶切，0.5％瓊酯糖凝膠電泳鑒定。陽(yáng)性重組腺病毒質(zhì)粒pAd-siRNA-XIAP電穿孔轉(zhuǎn)化大量擴(kuò)增后，PacⅠ酶切線性化，輔以脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)化293細(xì)胞包裝產(chǎn)生重組腺病毒Ad-siRNA-XIAP。氯化銫滴度超離心純化，倍比稀釋法測(cè)定Ad-siRNA-XIAP滴度；
　　3.通過

11、脂質(zhì)體介導(dǎo)將Ad-siRNA-XIAP轉(zhuǎn)染A2780/DDP細(xì)胞；綜合運(yùn)用MTT法、流式細(xì)胞儀分析、DNA凝膠電泳分析、Hoechs染色等方法，檢測(cè)XIAPsiRNA腺病毒載體作用于A2780/DDP細(xì)胞后,細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期﹑DNA碎片、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞耐藥特性的改變。
　　4.應(yīng)用Trizol一步法抽提卵巢癌及正常組織總RNA，分離純化mRNA并逆轉(zhuǎn)錄合成熒光分子(Cy3/Cy5)標(biāo)記cDNA探針，與含有8464種cDNA基因的

12、表達(dá)譜芯片雜交,分析Ad-siRNA-XIAP轉(zhuǎn)染前后A2780/DDP細(xì)胞差異表達(dá)的基因，對(duì)所獲得的基因進(jìn)行分子生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.干擾質(zhì)粒psiRNA-XIAP1、psiRNA-XIAP2及psiRNA-XIAP3經(jīng)限制性酶切鑒定和基因測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功；分別轉(zhuǎn)染A2780/DDP細(xì)胞24h后，PCR檢測(cè)XIAPmRNA水平顯著下降，westernblot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)psiRNA-XIAP1干擾效果最佳

13、，因此選擇干擾質(zhì)粒psiRNA-XIAP1構(gòu)建重組腺病毒Ad-siRNA-XIAP；
　　2.重組腺病毒Ad-siRNA-XIAP經(jīng)鑒定構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后可見綠色熒光表達(dá)，步驟簡(jiǎn)明并獲得了較高的病毒滴度；
　　3．pAdEasy-siRNA-XIAP轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，透射電鏡發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了典型的凋亡樣改變；而在空白對(duì)照及空載體對(duì)照組細(xì)胞中則未觀察到相同的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基

14、本正常，很少有細(xì)胞出現(xiàn)凋亡征象。AO染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞及細(xì)胞周期變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后凋亡細(xì)胞的比率逐漸增加，較對(duì)照組有顯著差異（P<0.05）；DNA凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，總DNA被降解產(chǎn)生成180～200bp整數(shù)倍的片斷，形成較明顯的DNA“梯形”條帶。
　　4．pAdEasy-siRNA-XIAP轉(zhuǎn)染能夠顯著提高A2780/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，順鉑聯(lián)合pAdEasy-siRNA-XIAP作用能夠明顯提高化療效果，增加腫

15、瘤細(xì)胞的凋亡。從結(jié)果看，pAdEasy-siRNA-XIAP轉(zhuǎn)染對(duì)腫瘤細(xì)胞化療敏感性的增強(qiáng)作用與腫瘤細(xì)胞內(nèi)XIAP基因的狀態(tài)與功能有關(guān)；
　　5.在pAdEasy-siRNA-XIAP載體轉(zhuǎn)染前后A2780/DDP細(xì)胞中出現(xiàn)差異表達(dá)的基因功能群,初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)pAdEasy-siRNA-XIAP載體轉(zhuǎn)染A2780/DDP細(xì)胞前后，存在的大量差異表達(dá)基因涵蓋了多種不同的功能群落，涉及基因包括信號(hào)與蛋白傳遞、癌基因與原癌基因、免疫和

16、發(fā)育相關(guān)基因、凋亡基因，以及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄因子等。
　　結(jié)論：
　　1.實(shí)驗(yàn)中采用pSilencer載體系統(tǒng)成功構(gòu)建了干擾質(zhì)粒pSilencer-XIAP1、pSilencer-XIAP2和pSilencer-XIAP3，分別轉(zhuǎn)染卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞A2780/DDP，敲除其XIAPmRNA，敲除效率均較高，其中以pSilencer-XIAP1效果更佳；
　　2.采用pSilencer-XIAP1和腺病毒pAdEa

17、sy系統(tǒng)成功構(gòu)建了重組腺病毒pAdEasy-siRNA-XIAP，步驟簡(jiǎn)明并獲得了較高的病毒滴度，從而將RNA聚合酶Ⅲ和啟動(dòng)子H1的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)合而為一；
　　3.重組腺病毒pAdEasy-siRNA-XIAP可顯著抑制人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞A2780/DDP中XIAP的表達(dá)，對(duì)A2780/DDP細(xì)胞XIAPmRNA的敲除效率明顯高于干擾質(zhì)粒pSilencer-XIAP1；
　　4.腺病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)能夠顯著抑制人卵巢癌