以XIAP基因為靶點逆轉(zhuǎn)卵巢癌多藥耐藥的研究.pdf

1、研究背景：
　　目前對卵巢癌的治療原則是以手術(shù)為主，輔以化療等綜合治療。隨著有效化療方案廣泛應(yīng)用，卵巢惡性生殖細胞腫瘤的治療效果有了明顯提高，死亡率由90％降至10％，但卵巢上皮癌的治療效果確一直未獲根本改善，5年生存率徘徊于30％～40％。因此，卵巢癌的診治仍面臨許多困難和挑戰(zhàn)，伴隨臨床標準化化療而來的腫瘤細胞的原發(fā)性和/或繼發(fā)性耐藥已成為影響卵巢癌臨床治療效果的重要障礙。70％的卵巢癌患者在治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā),關(guān)鍵原因之一是卵巢癌

2、細胞對鉑類化療藥物產(chǎn)生耐藥。卵巢癌對鉑類藥物的耐藥機制十分復(fù)雜，涉及藥物蓄積、代謝、凋亡、DNA損傷修復(fù)等多方面，尚難以定論哪一個方面占主要地位，且許多機制仍不清楚。許多已知和未知的因素參與癌細胞產(chǎn)生耐藥性的過程從而為耐藥性的逆轉(zhuǎn)帶來困難。因此了解卵巢腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥的機制以及各種細胞生物學(xué)指標在耐藥產(chǎn)生中所起的作用十分重要，可以指導(dǎo)我們更為合理的選擇相應(yīng)的化療方案，并選擇相應(yīng)的特異的耐藥修飾劑，可不同程度改善卵巢癌的預(yù)后。隨著生命科學(xué)

3、的飛速發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)的不斷改進，從基因水平去研究耐藥機制已成為人類腫瘤研究的熱點。積極尋找新的卵巢癌防治手段，進一步提高卵巢癌的總體治療水平，在我國將具有積極而重要的現(xiàn)實意義。
　　凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein,IAPs)是一類在結(jié)構(gòu)上具有同源性的細胞內(nèi)源性凋亡抑制蛋白家族。人類IAPs的主要成員X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linkedinhibitorofapoptosisprotein

4、,XIAP)是IAP家族中最有效力的caspase抑制物,也是分子結(jié)構(gòu)研究得最清楚的IAP家族成員。研究發(fā)現(xiàn)XIAP的生物學(xué)功能多樣，對腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有多方面的影響，XIAP對細胞凋亡和細胞分裂周期有雙重調(diào)控作用，具有選擇性的組織細胞分布特征以及特殊的抑制細胞凋亡的作用機理，可能成為腫瘤診斷的標志物以及腫瘤基因治療的新靶點。學(xué)者們對XIAP在腫瘤發(fā)病機制中的作用和靶向治療中的應(yīng)用等研究正逐步深入。本課題將利用腺病毒載體介導(dǎo)siRN

5、A片段抑制XIAP基因的表達，進一步闡明卵巢癌多藥耐藥的可能機制，為卵巢癌的基因治療提供一個新的可能的靶點及相關(guān)理論依據(jù)，為卵巢腫瘤的治療開辟更廣闊的路徑。
　　目的：
　　利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，以XIAP基因為靶基因，以卵巢癌順鉑耐藥細胞A2780/DDP為靶細胞，設(shè)計構(gòu)建針對XIAP基因的siRNA真核表達質(zhì)粒，進行測序鑒定及干涉效率的評價，利用腺病毒載體系統(tǒng)介導(dǎo)RNA干涉片段轉(zhuǎn)染卵巢癌耐藥細胞，獲得XIAP基

6、因表達抑制細胞，并檢測該表達載體轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞系A(chǔ)2780/DDP后XIAP基因表達情況、卵巢癌細胞生物學(xué)行為以及多藥耐藥特性的影響，并結(jié)合基因芯片技術(shù)對其可能機制及作用通路進行初步研究。將有望發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)上皮性卵巢癌多藥耐藥的新途徑，為卵巢癌的基因治療提供新的技術(shù)方案和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.干擾質(zhì)粒psiRNA－XIAP的構(gòu)建、篩選及鑒定
　?、賡iRNA靶序列的選擇及其模板DNA的設(shè)計：利用GeneBank得

7、到XIAP的mRNA序列，根據(jù)siRNA靶序列遴選設(shè)計原則，并經(jīng)BLAST序列同源性分析后，選擇三條特異性siRNA靶序列，進而設(shè)計、合成其相應(yīng)的模板DNA；
　　②干擾質(zhì)粒psiRNA－XIAP的構(gòu)建、篩選及鑒定：磷酸化各單鏈DNA片段之5’末端，退火產(chǎn)生相應(yīng)的雙鏈DNA，分別插入BglⅠ和HindⅢ雙酶切空白質(zhì)粒pSilencer，得到干擾質(zhì)粒psiRNA－XIAP1、2、3，分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑選陽性菌落，裂解法小量抽

8、提質(zhì)粒DNA，BglⅠ和HindⅢ雙酶切，1％瓊酯糖凝膠電泳初步鑒定后進行測序；
　?、酆Y選XIAPmRNA敲除效率最佳的干擾質(zhì)粒：中量提取各干擾質(zhì)粒psiRNA－XIAP1、2、3，輔以脂質(zhì)體Lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染人卵巢癌順鉑耐藥細胞系A(chǔ)2780/DDP，對照組為空白對照組和空載體對照組。24h后，RT-PCR、Westernblot檢測各組A2780/DDP細胞的XIAP表達水平，據(jù)此選擇干擾效果最佳的的干

9、擾質(zhì)粒以構(gòu)建重組腺病毒pAd-siRNA-XIAP；
　　2.重組腺病毒pAd-siRNA-XIAP的構(gòu)建、鑒定、包裝及滴度的測定：XbalⅠ和XholⅠ雙酶切干擾質(zhì)粒psiRNA-XIAP得到siRNA-XIAP表達片段，插入XbalⅠ和XholⅠ雙酶切的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack，得到pAdTrack-siRNA-XIAP，PmeⅠ酶切線性化后，轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183，二者同源重組產(chǎn)

10、生重組腺病毒質(zhì)粒pAd-siRNA-XIAP?？敲顾乜剐院Y選，挑取陽性克隆，抽提質(zhì)粒pAd-siRNA-XIAP，BamHⅠ酶切，0.5％瓊酯糖凝膠電泳鑒定。陽性重組腺病毒質(zhì)粒pAd-siRNA-XIAP電穿孔轉(zhuǎn)化大量擴增后，PacⅠ酶切線性化，輔以脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)化293細胞包裝產(chǎn)生重組腺病毒Ad-siRNA-XIAP。氯化銫滴度超離心純化，倍比稀釋法測定Ad-siRNA-XIAP滴度；
　　3.通過

11、脂質(zhì)體介導(dǎo)將Ad-siRNA-XIAP轉(zhuǎn)染A2780/DDP細胞；綜合運用MTT法、流式細胞儀分析、DNA凝膠電泳分析、Hoechs染色等方法，檢測XIAPsiRNA腺病毒載體作用于A2780/DDP細胞后,細胞增殖、細胞周期﹑DNA碎片、細胞凋亡及細胞耐藥特性的改變。
　　4.應(yīng)用Trizol一步法抽提卵巢癌及正常組織總RNA，分離純化mRNA并逆轉(zhuǎn)錄合成熒光分子(Cy3/Cy5)標記cDNA探針，與含有8464種cDNA基因的

12、表達譜芯片雜交,分析Ad-siRNA-XIAP轉(zhuǎn)染前后A2780/DDP細胞差異表達的基因，對所獲得的基因進行分子生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.干擾質(zhì)粒psiRNA-XIAP1、psiRNA-XIAP2及psiRNA-XIAP3經(jīng)限制性酶切鑒定和基因測序證實構(gòu)建成功；分別轉(zhuǎn)染A2780/DDP細胞24h后，PCR檢測XIAPmRNA水平顯著下降，westernblot結(jié)果進一步證實psiRNA-XIAP1干擾效果最佳

13、，因此選擇干擾質(zhì)粒psiRNA-XIAP1構(gòu)建重組腺病毒Ad-siRNA-XIAP；
　　2.重組腺病毒Ad-siRNA-XIAP經(jīng)鑒定構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染293細胞后可見綠色熒光表達，步驟簡明并獲得了較高的病毒滴度；
　　3．pAdEasy-siRNA-XIAP轉(zhuǎn)染對卵巢癌細胞的生長有抑制作用，透射電鏡發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后卵巢癌細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了典型的凋亡樣改變；而在空白對照及空載體對照組細胞中則未觀察到相同的細胞超微結(jié)構(gòu)改變，細胞結(jié)構(gòu)基

14、本正常，很少有細胞出現(xiàn)凋亡征象。AO染色及流式細胞儀檢測細胞及細胞周期變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后凋亡細胞的比率逐漸增加，較對照組有顯著差異（P<0.05）；DNA凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，總DNA被降解產(chǎn)生成180～200bp整數(shù)倍的片斷，形成較明顯的DNA“梯形”條帶。
　　4．pAdEasy-siRNA-XIAP轉(zhuǎn)染能夠顯著提高A2780/DDP細胞對順鉑的敏感性，順鉑聯(lián)合pAdEasy-siRNA-XIAP作用能夠明顯提高化療效果，增加腫

15、瘤細胞的凋亡。從結(jié)果看，pAdEasy-siRNA-XIAP轉(zhuǎn)染對腫瘤細胞化療敏感性的增強作用與腫瘤細胞內(nèi)XIAP基因的狀態(tài)與功能有關(guān)；
　　5.在pAdEasy-siRNA-XIAP載體轉(zhuǎn)染前后A2780/DDP細胞中出現(xiàn)差異表達的基因功能群,初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)pAdEasy-siRNA-XIAP載體轉(zhuǎn)染A2780/DDP細胞前后，存在的大量差異表達基因涵蓋了多種不同的功能群落，涉及基因包括信號與蛋白傳遞、癌基因與原癌基因、免疫和

16、發(fā)育相關(guān)基因、凋亡基因，以及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄因子等。
　　結(jié)論：
　　1.實驗中采用pSilencer載體系統(tǒng)成功構(gòu)建了干擾質(zhì)粒pSilencer-XIAP1、pSilencer-XIAP2和pSilencer-XIAP3，分別轉(zhuǎn)染卵巢癌順鉑耐藥細胞A2780/DDP，敲除其XIAPmRNA，敲除效率均較高，其中以pSilencer-XIAP1效果更佳；
　　2.采用pSilencer-XIAP1和腺病毒pAdEa

17、sy系統(tǒng)成功構(gòu)建了重組腺病毒pAdEasy-siRNA-XIAP，步驟簡明并獲得了較高的病毒滴度，從而將RNA聚合酶Ⅲ和啟動子H1的特點和優(yōu)勢合而為一；
　　3.重組腺病毒pAdEasy-siRNA-XIAP可顯著抑制人卵巢癌順鉑耐藥細胞A2780/DDP中XIAP的表達，對A2780/DDP細胞XIAPmRNA的敲除效率明顯高于干擾質(zhì)粒pSilencer-XIAP1；
　　4.腺病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)能夠顯著抑制人卵巢癌