以agrA為靶點(diǎn)的反義鎖核酸抗MRSA活性研究.pdf

1、目的:
　　金黃色葡萄球菌是一種重要的人類(lèi)致病菌,能夠引起皮膚和軟組織感染,膿毒血癥,中毒性休克和壞死性肺炎等一系列中度或重度感染性疾病。近些年來(lái),由于耐藥菌株的出現(xiàn),特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus,MRSA)的快速播散,以及耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌(vancomycin-resistantMRSAstrains,VRSA),甚至是多重耐藥MRSA的不斷檢出,使臨床上可用

2、于治療金黃色葡萄球菌感染的抗菌藥物屈指可數(shù)。同時(shí)MRSA有形成生物膜的能力,從而阻礙抗生素發(fā)揮抗菌作用,這又進(jìn)一步加劇了抗MRSA感染治療的難度。而MRSA感染的死亡率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-susceptibleS.aureus,MSSA)感染的死亡率,這些迫使我們必須探索新的抗MRSA策略。近年來(lái),阻斷群體感受系統(tǒng)(Quorumsensing,QS)能夠有效降低細(xì)菌的致病力、減小生存壓力和不易誘

3、發(fā)耐藥,因而成為倍受青睞的抗菌新策略之一。本研究的目的是利用反義技術(shù)抑制金黃色葡萄球菌agr群體感受系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子agrA的表達(dá),阻斷agr信號(hào)通路,從而降低金黃色葡萄球菌的致病力,為抗MRSA感染提供一個(gè)潛在的靶點(diǎn)和一種新思路。
　　方法:
　　1.針對(duì)agrAmRNA反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)合成:在NCBI的Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索agrAmRNA的序列,并利用BLAST工具比對(duì)agrA在不同葡萄球菌菌屬中的同源性。

4、首先應(yīng)用PrimerPremier5.0軟件,預(yù)測(cè)與agrAmRNA特異結(jié)合的反義寡核苷酸序列(18~24bp);然后再用RNAstructure4.5軟件預(yù)測(cè)agrA的mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)并計(jì)算反義寡核苷酸與agrAmRNA各靶點(diǎn)結(jié)合時(shí)的自由能;最后,綜合PrimerPremier5.0和RNAstructure4.5分析結(jié)果選取參數(shù)較優(yōu)的反義寡核苷酸,進(jìn)行鎖核酸修飾,并與透膜肽(KFF)3K共價(jià)連接,制備成與透膜肽偶聯(lián)的鎖核酸(Cel

5、lpenetratepeptideconjugatedlockedneucleicacid,PLNA)。
　　2.抗agrA反義鎖核酸PLNA34和PLNA522對(duì)MRSA生長(zhǎng)的影響:以社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(CA-MRSA)菌株LAC(USA300)作為實(shí)驗(yàn)菌株,通過(guò)觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線對(duì)篩選的兩條PLNA(PLNA34和PLNA522)的抗菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)中PLNA34和PLNA522的藥物終濃度分別為12.5μ

6、M,25μM和40μM,同時(shí)設(shè)PBS為空白對(duì)照組。
　　3.抗agrA反義鎖核酸PLNA34和PLNA522降低MRSA毒力基因表達(dá)的研究:將LAC菌液與PLNA34和PLNA522共孵育,5h后收集菌體和上清。利用熒光定量PCR檢測(cè)PLNA對(duì)agrA及受其調(diào)控的毒力因子psmα和psmβ表達(dá)的抑制作用,和agr的效應(yīng)分子RNAⅢ及其調(diào)控的毒力基因hla和pvl表達(dá)的抑制作用;利用westernblot檢測(cè)PLNA對(duì)hla編碼的α

7、-溶血素的抑制效果;利用溶血試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)菌培養(yǎng)上清中溶血素的分泌情況;通過(guò)人中性粒細(xì)胞裂解和趨化實(shí)驗(yàn)分析細(xì)菌培養(yǎng)上清中PSMs的分泌情況。實(shí)驗(yàn)中PLNA34和PLNA522的藥物終濃度分別為3.125μM,6.25μM和12.5μM,同時(shí)設(shè)PBS為空白對(duì)照組。
　　4.抗agrA反義鎖核酸PLNA34的體內(nèi)活性研究:構(gòu)建C57BL/6J小鼠皮下感染模型,將PLNA34與細(xì)菌菌液混合后立即注射到小鼠皮下,觀察PLN34對(duì)C57BL/6

8、J小鼠膿腫創(chuàng)面大小的影響;通過(guò)測(cè)定C57BL/6J小鼠皮下膿腫中細(xì)菌CFU,觀察PLNA34對(duì)機(jī)體清除細(xì)菌的促進(jìn)作用;通過(guò)C57BL/6J小鼠皮下膿腫的HE染色,觀察PLNA34對(duì)小鼠皮膚組織的病理保護(hù)作用。PLNA34的藥物終濃度為40μM,PBS作為空白對(duì)照組。
　　結(jié)果:
　　1.針對(duì)agrAmRNA反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)合成:Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的金黃色葡萄球菌agrA的序列就是其mRNA序列;BLAST結(jié)果

9、顯示agrA在金黃色葡萄球菌中的同源性很高,甚至與某些表皮葡萄球菌的相似度也達(dá)到80％,表明agrA可作為特異性的反義靶點(diǎn)。結(jié)合PrimerPremier5.0和RNAstructure4.5分析結(jié)果優(yōu)選取2條潛在的反義寡核苷酸序列,進(jìn)行鎖核酸修飾后與透膜肽(KFF)3K共價(jià)連接,分別為PLNA34和PLNA522。
　　2.抗agrA反義鎖核酸對(duì)MRSA生長(zhǎng)的影響:PLNA34組,PLNA522組和PBS對(duì)照組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光

10、值基本一致,繪制的生長(zhǎng)曲線也幾乎完全重合,說(shuō)明PLNA34和PLNA522不影響LAC的生長(zhǎng),體外無(wú)抗菌活性,這與設(shè)計(jì)理論相符。
　　3.抗agrA反義鎖核酸PLNA34和PLNA522降低MRSA毒力基因表達(dá):熒光定量PCR結(jié)果顯示,與PBS空白對(duì)照組相比,在藥物濃度均為12.5μM時(shí)PLNA34和PLNA522都能夠顯著抑制靶基因agrAmRNA(P<0.001)和agr效應(yīng)分子RNAⅢ(P<0.001)的表達(dá),同時(shí)能明顯抑制

11、被RNAⅢ調(diào)控的毒力基因hla(P均<0.001)和pvl(P均<0.001),也顯著下調(diào)受AgrA調(diào)控的重要毒力基因psmα(P均<0.001)和psmβ的表達(dá)(PLNA34,P<0.001;PLNA522,P<0.01)。但在相同濃度(均為12.5μM)時(shí),PLNA34比PLNA522能更有效地抑制上述6個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄(P<0.001),且具有劑量依賴(lài)效應(yīng)。Westernblot結(jié)果顯示,PLNA34組α-溶血素蛋白的表達(dá)受到了明顯的

12、抑制且呈劑量依賴(lài)性,12.5μMPLNA34組細(xì)菌幾乎未表達(dá)α-溶血素,而PLNA522組α-溶血素蛋白的表達(dá)僅受到了輕度的抑制。溶血試驗(yàn)表明,PLNA522組與PBS空白對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異,不同濃度的PLNA34均能顯著降低溶血率(P<0.01)且具有劑量依賴(lài)性。相同濃度(均為12.5μM)作用下,PLNA34組較PLNA522組能有效降低溶血率(P<0.01)。中性粒細(xì)胞裂解和趨化實(shí)驗(yàn)表明,PLNA522組與PBS空白對(duì)照組相比

13、無(wú)顯著性差異,6.25μM和12.5μMPLNA34組顯著降低細(xì)胞的裂解程度(P<0.05),不同濃度PLNA34組顯著降低細(xì)胞的趨化程度(3.125μM組與6.25μM組,P<0.01;12.5μM組,P<0.001)。以上結(jié)果初步說(shuō)明PLNA34的反義抑制效果優(yōu)于PLNA522。
　　4.抗agrA反義鎖核酸PLNA34的體內(nèi)活性研究:在C57BL/6J小鼠皮下感染模型中,PLNA34能夠顯著減小感染傷口的大小,抑制膿腫的形成