落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中DNA甲基化分析及MET1、DDM1克隆研究.pdf

1、植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生是新品種規(guī)模化無性繁殖的主要手段，也是植物細(xì)胞全能性研究的理想模式系統(tǒng)，在林木育種、種質(zhì)保存和遺傳轉(zhuǎn)化等方面都有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。然而，很多植物體細(xì)胞胚發(fā)生體系還不完善，存在技術(shù)難度大、質(zhì)量不高、發(fā)生數(shù)量低、畸形胚比例高且難以同步化等問題。體細(xì)胞胚胎發(fā)生作為落葉松大規(guī)模無性繁殖的重要途徑，深入研究體細(xì)胞胚發(fā)生的表觀遺傳調(diào)控機(jī)理，揭示其調(diào)控模式，可為進(jìn)一步調(diào)控低質(zhì)量胚胎發(fā)生體系向高效穩(wěn)定胚胎發(fā)生體系轉(zhuǎn)變提供理論基

2、礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。本研究以雜種落葉松（Larixleptolepis×L. principis-rupprechtii）胚性細(xì)胞系Y35為實(shí)驗(yàn)材料，通過MSAP（Methylation-Sensitive Amplified Polymorphism）技術(shù)，以落葉松體細(xì)胞胚的原胚團(tuán)時(shí)期（0 h）以及ABA誘導(dǎo)的早期單胚（0.5 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d）、中期單胚（7 d、14 d）、晚期單胚（21 d）、早期子

3、葉胚（28 d）、中期子葉胚（35 d）、晚期子葉胚（42 d）等7個(gè)發(fā)育階段14個(gè)發(fā)育時(shí)期的體細(xì)胞胚為實(shí)驗(yàn)材料，研究其DNA甲基化水平與模式變化，并首次克隆了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶MET1和染色質(zhì)重塑因子DDM1基因全長cDNA，進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測和分子進(jìn)化等生物信息學(xué)分析。依據(jù)所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，探討落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，為落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：
　　1.DNA甲基化研究表明：體細(xì)胞胚胎

4、發(fā)生過程中3-42 d時(shí)5′-CCGG-3′胞嘧啶總甲基化率負(fù)對(duì)數(shù)值（y）隨時(shí)間（x）變化擬合函數(shù)y=－2E-08x6+3E-06x5－0.0002x4+0.004x3－0.0514x2+0.2885x+0.5398（R2=0.973）。體細(xì)胞胚發(fā)育時(shí)期與總甲基化率負(fù)對(duì)數(shù)極顯著，表明在一定程度上可以推測某些發(fā)育時(shí)期的總DNA甲基化率。
　　2.總甲基化率在14個(gè)時(shí)期的中期單胚時(shí)期（14 d）最高，晚期子葉胚時(shí)期（42 d）最低；全

5、甲基化率（雙鏈5′-CmCGG-3′）的最高在ABA誘導(dǎo)后6 h，而最低在晚期子葉胚的42 d；半甲基化率（單鏈5′-mCCGG-3′）最高時(shí)期是ABA誘導(dǎo)2 d，而最低是0.5 h。每兩相鄰時(shí)期的DNA甲基化模式變化分析發(fā)現(xiàn)：在5′-CCGG-3′序列的胞嘧啶上，ABA誘導(dǎo)0.5-6 h時(shí)，超甲基化最多；而在早期單胚向中期子葉胚轉(zhuǎn)變的5-7 d時(shí)，超甲基化最少。同時(shí)，在早期單胚向中期子葉胚轉(zhuǎn)變的5-7 d，去甲基化最多；而在中期單胚到

6、晚期單胚發(fā)生的14-21 d，去甲基化最少。
　　3.與原胚團(tuán)時(shí)期相比，各時(shí)期DNA甲基化模式變化分析發(fā)現(xiàn)：ABA誘導(dǎo)第5 d時(shí)， 也即體細(xì)胞胚胎發(fā)生至早期單胚時(shí)，超甲基化最多；而在第7 d時(shí)，即早期單胚開始向中期單胚發(fā)育時(shí)，超甲基化最少。同時(shí)，ABA誘導(dǎo)第14 d，即體細(xì)胞胚胎發(fā)生至中期單胚階段，去甲基化最多；而在第2 d時(shí)，去甲基化最少。
　　4.部分差異條帶回收、測序、比對(duì)發(fā)現(xiàn)與編碼核糖體蛋白S13（ribo

7、somal protein S13）同源的序列，該片段來自E37+H/M61引物組合對(duì)ABA誘導(dǎo)后第14 d中期單胚的MspI酶切連接產(chǎn)物的擴(kuò)增。
　　5.利用MET1保守域序列兼并引物進(jìn)行落葉松cDNA擴(kuò)增，得到403 bp的特異片段，分析得知為落葉松MET1的特異序列，其65-77 aa為酶活性中心。分別通過3' RACE和5' RACE得到1404 bp和3788 bp片段，獲得全長5303 bp。其中，1-77 bp為5'

8、 UTR區(qū)，4872-5303 bp為3' UTR區(qū)，編碼1731個(gè)氨基酸，分子量194.67 kDa，命名為LlMET1。通過PFAM和CDD（Conserved Domain Database，NCBI）蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測：LlMET1含有兩個(gè)BAH結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)DNMT1-RFD結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)DNA甲基酶結(jié)構(gòu)域，以及Dcm等多個(gè)結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹研究發(fā)現(xiàn)LlMET1和油棕（Elaeis guineensis）DNA甲基轉(zhuǎn)移酶MET1的進(jìn)化關(guān)

9、系相近。搜索Y35體細(xì)胞胚成熟與原胚團(tuán)時(shí)期的SSH差減文庫，發(fā)現(xiàn)編碼染色質(zhì)重塑因子相關(guān)蛋白DDM1的片段，通過RACE進(jìn)一步擴(kuò)增得cDNA全長。系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)落葉松的LlDDM1與小立碗蘚（Physcomitrella patens）的PpDDM1具有較近的進(jìn)化關(guān)系。
　　綜上所述，落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中，存在著頻繁的DNA甲基化水平變化，并在一定時(shí)期與體細(xì)胞胚發(fā)生時(shí)間具有一定關(guān)系。同時(shí)，也存在頻繁的DNA甲基化模式變化。DN