化學合成siRNA對宮頸癌細胞SiHa中E6基因表達的抑制作用.pdf

1、目的：探討體外化學合成的HPV(human papolloma virus)16E6的siRNA對HPV16陽性的宮頸癌細胞系SiHa細胞中HPV16 E6基因的抑制作用和對SiHa細胞生物學行為變化的誘導作用。 方法：化學合成三條針對HPV16 E6的siRNA序列，用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染SiHa細胞。實驗分兩組：未轉(zhuǎn)染組和siRNA轉(zhuǎn)染組。用半定量RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式擴增)技術(shù)分別檢測未轉(zhuǎn)染組及siRNA轉(zhuǎn)染后24h

2、，48h，72h時HPV16E6基因mRNA的表達，四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法測定細胞活性，流式細胞技術(shù)(FCM)檢測細胞周期變化，細胞免疫化學技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后細胞中p53蛋白表達水平的變化，透射電鏡觀察轉(zhuǎn)染前后細胞形態(tài)學變化。 結(jié)果：1.3條siRNA均能有效抑制E6mRNA的轉(zhuǎn)錄表達，以siRNA1作用效果最為明顯。 2.MTT檢測結(jié)果顯示20nmol/L、50nmol/L和80nmol/L終濃度轉(zhuǎn)染后細胞增殖活

3、性均有所下降，其中以50nmol/L轉(zhuǎn)染時增殖活性下降最明顯。 3.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后G0/G1期細胞數(shù)占生長周期細胞數(shù)的比例增多，即表現(xiàn)為G1期阻滯，S期細胞的比例降低。 4.細胞免疫化學檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染72h后p53蛋白表達水平增高，轉(zhuǎn)染前后差異有顯著性(P<0.05)。 5.轉(zhuǎn)染72 h后透射電鏡下可見細胞細胞質(zhì)濃縮，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡。 結(jié)論：化學合成siRNA可有效沉默SiHa細胞E6基因