大薊抗腫瘤成分的篩選及其用機(jī)制的研究.pdf

1、大薊為菊科管狀花亞科菜薊族薊屬植物Cirsium faponicum DC．的干燥地上部分或根，多年生草本，高100—150cm，莖直立，密被白毛，葉互生；葉片倒卵狀長橢圓形，邊緣具淺裂和斜刺，被毛；5—6月開花，頭狀花序頂生，花單生，紫紅色，瘦果扁橢圓形，生于山野路邊，以全草和根入藥，我國大部分地區(qū)有分布。全草灰綠色，大薊性涼，味甘、苦、歸心、肝經(jīng)，功效為涼血止血、祛瘀痛，主治吐血、衄血、尿血、血淋、血崩、帶下、腸風(fēng)、腸癰、癰瘍腫毒、

2、疔瘡、高血壓及肝炎等。其化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有黃酮、黃酮苷，揮發(fā)油、三萜和甾醇等物質(zhì)。大薊在民間驗方多用于治療癌癥，如：大薊根、三白草根治肝癌；鮮大薊葉與雞蛋清攪拌后貼于患處，可治乳腺癌等。趙鵬等用大薊提取物對Hep細(xì)胞毒性的研究表明：大薊提取物能抑制Hep細(xì)胞的生長，并能提高Hep荷瘤小鼠的免疫功能等。但對其抗腫瘤成分及其抗腫瘤機(jī)制未見報道。 本論文以大薊為研究材料，應(yīng)用藥物化學(xué)、分析化學(xué)、生物技術(shù)、藥理學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分

3、子生物學(xué)等方法，通過有機(jī)溶劑提取、硅膠層析和凝膠層析，以H22和S180為腫瘤模型篩選大薊的抗腫瘤活性成分，并從免疫和誘導(dǎo)調(diào)亡方面探明其抗腫瘤機(jī)制，為抗腫瘤新藥的開發(fā)及大薊的利用提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。 以H22和S180為腫瘤模型，用大薊水提物、醇提物和乙酸乙脂萃取物等抑制腫瘤的生長，乙酸乙脂萃取物的抑制作用最明顯，其抑瘤率為40.42％。紫外圖譜和特征顯色鑒別出大薊中抗腫瘤的活性成分主要為黃酮類成分，以蘆丁為對照品，用紫外分

4、光光度計測定其總黃酮的含量為65.89％。 用硅膠柱分離大薊中的黃酮類成分，得到兩個黃酮單體，并用紫外、紅外、質(zhì)譜等光譜分析，確定兩個黃酮單體分別為柳穿魚葉苷和5，7二羥基．6，4-二甲氧基黃酮，再以S180為腫瘤模型比較大薊總黃酮及兩個單體化合物的抗腫瘤作用，結(jié)果表明大薊的兩種黃酮混合物抗腫瘤作用強(qiáng)于兩個單體化合物。 為探明大薊總黃酮的抗腫瘤作用與機(jī)體免疫的關(guān)系，以H22和S180為腫瘤模型，研究大薊總黃酮對腫瘤小鼠的

5、免疫器官指數(shù)、溶血素、脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化率及NK細(xì)胞活性等方面的影響，結(jié)果表明大薊總黃酮和兩個黃酮單體均能提高免疫功能的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)和溶血素水平，促進(jìn)脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化率及增強(qiáng)NK細(xì)胞活性。但大薊總黃酮的作用強(qiáng)于兩個單體化合物，尤其以50mg／ml為最佳，與模型組比較差異極顯著(*P<0.01)。表明大薊總黃酮的抗腫瘤作用是通過提高機(jī)體的免疫功能來實現(xiàn)的，并且總黃酮作用強(qiáng)于單個化合物，兩個單體化合物在機(jī)體中的抗腫瘤作用是相互促進(jìn)的。 以

6、人肝癌SMMC-7721細(xì)胞和人子宮癌Hela細(xì)胞為模型，通過MTT法、瓊脂糖凝膠電泳和DAPI染色對大薊總黃酮誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡進(jìn)行研究，結(jié)果表明：大薊總黃酮對SMMC-7721和Hela的IC50分別為93.64μg／ml和85.12μg/ml：瓊脂糖凝膠電泳表明，實驗組細(xì)胞可見清晰的DNA“梯子”(Ladder)，呈劑量依賴性，而空白組細(xì)胞不見DNA“梯子”。DAPI染色后在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組癌細(xì)胞有明顯的凋亡小體，故認(rèn)為大薊總

7、黃酮可能是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡來實現(xiàn)抗腫瘤作用的。 以研究大薊總黃酮對腫瘤小鼠IL-1、IL-2和腫瘤壞死因子的影響，從分子水平上探明大薊總黃酮抗腫瘤免疫的機(jī)理。通過提取給藥組和空白組脾細(xì)胞和腹腔細(xì)胞的總RNA，采用具有高靈敏度的逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)從腫瘤小鼠脾細(xì)胞和腹腔細(xì)胞中檢測細(xì)胞因子IL-l和IL-2的mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，大薊總黃酮具有促進(jìn)IL-1和IL-2mRNA表達(dá)的作用。 利用正交

8、實驗優(yōu)化大薊總黃酮的提取工藝，并用HPLC測定總黃酮中各黃酮的含量，其色譜條件為流動相A為PH=3.0的磷酸溶液：流動相B為甲醇。梯度洗脫，0～8 min 30％A～50％A：8～40 min 50％A。流速0.76mL／min，二極管陣列檢測器檢測。紫外檢測波長280nm。并分別準(zhǔn)確吸取柳穿魚葉苷及5，7二羥基一6，4’一二甲氧基黃酮對照品溶液2、4、6、8、10和12μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖峰面積。以峰面積(A)對進(jìn)樣量(

9、w)進(jìn)行回歸計算，分別得回歸方程：A<,柳穿魚葉苷>=8624.2w+7，r=0.9996：A<,5.7二羥基一6.4，一二甲氧基黃酮>=13807W-948.53，r=0.9994。實驗結(jié)果表明；大薊黃酮提取的最佳工藝為70％乙醇提取兩次，第1次12倍量1h，第2次10倍量30min。 綜上所述，大薊的抗腫瘤活性成分主要為黃酮類物質(zhì)，并且抗腫瘤活性是通過提高機(jī)體免疫功能和誘導(dǎo)癌細(xì)胞調(diào)亡來實現(xiàn)的。大薊總黃酮的最佳提取條件為70％