皮蛋抗腫瘤功效及其機(jī)制的研究.pdf

1、皮蛋是我國傳統(tǒng)蛋制品，其藥用功效收錄于《隨息居飲食譜》和《醫(yī)林纂要》，其主要功效為瀉熱、醒酒、去大腸火，治瀉痢等。近代皮蛋水解物的實驗研究發(fā)現(xiàn)其抗氧化和抗炎效果顯著。但是對皮蛋抗腫瘤活性及其機(jī)制研究較少，本文從動物水平上研究了皮蛋的體內(nèi)安全性和生理功效，從細(xì)胞水平上研究了皮蛋消化物的抗腫瘤功能及其作用機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　(1)以健康SD大鼠為研究對象，連續(xù)灌胃皮蛋80d，研究皮蛋對大鼠常規(guī)指標(biāo)和肝臟生化指標(biāo)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，

2、皮蛋可以增加大鼠體重，降低大鼠肝臟中TG、TCHO、LDL-C/HDL-C的水平，其中劑量為4.2mg/mL時的效果最明顯。臟器指標(biāo)的測定表明，皮蛋不會造成大鼠肝臟、腎臟、脾臟的病變。觀察肝臟組織切片發(fā)現(xiàn)皮蛋對肝臟組織的結(jié)構(gòu)幾乎沒有影響，沒有脂肪顆粒的出現(xiàn)。進(jìn)一步對大鼠肝臟中炎性因子的測量發(fā)現(xiàn)，皮蛋可以降低大鼠肝臟中IL-6和TNF-α的表達(dá)，且具有顯著性差異。這些結(jié)果表明，皮蛋不僅不會給健康大鼠帶來不良影響，還可以通過下調(diào)大鼠肝臟中的

3、脂質(zhì)水平和促炎細(xì)胞因子的水平使其在大鼠體內(nèi)具有降脂和抗炎的作用。
　　(2)基于模擬胃腸道消化探究皮蛋在胃腸道消化過程中的抗氧化能力，并選取抗氧化能力最高的皮蛋消化物進(jìn)行后續(xù)的抗腫瘤細(xì)胞實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，皮蛋在模擬胃腸道消化過程中表現(xiàn)出較高的抗氧化能力，胃腸道消化前的皮蛋還原能力要比消化后的還原能力強(qiáng)，清除羥基自由基能力最高為99.80％，清除DPPH自由基能力最高為68.40％，清除ABTS自由基能力最高為54.90％。以Caco

4、-2細(xì)胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)在胃消化2h和腸消化2h時，皮蛋對Caco-2細(xì)胞的增殖抑制能力最高，且IC50值為5.75mg/mL。觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)皮蛋消化物能顯著破壞Caco-2細(xì)胞的結(jié)構(gòu)并引起細(xì)胞的凋亡。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，當(dāng)皮蛋消化產(chǎn)物濃度為5mg/mL及10mg/mL時，Caco-2細(xì)胞的凋亡率分別為4.79％和5.29％，其中大部分凋亡均發(fā)生在凋亡晚期。在caspase-3活性測定實驗中發(fā)現(xiàn)，皮蛋可以顯著增加caspase-3

5、活性。這些結(jié)果表明，皮蛋不僅具有體外抗氧化活性，還能抑制Caco-2細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。
　　(3)為了進(jìn)一步研究皮蛋的抗腫瘤作用和抗腫瘤機(jī)制。以HepG2和HT-29為細(xì)胞模型，研究皮蛋對其細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞凋亡的影響。觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)皮蛋處理后的腫瘤細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞核模糊。采用RT-qPCR的方法測定了細(xì)胞中Bcl-2、Bax、COX-2mRNA表達(dá)量。結(jié)果顯示，皮蛋可以上調(diào)Bax mRNA的表達(dá)量，下

6、調(diào)Bcl-2mRNA和COX-2mRNA的表達(dá)量，且具有劑量依賴性。通過Elisa實驗檢測了細(xì)胞中caspase-3和caspase-9蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)皮蛋可以使這兩種蛋白質(zhì)的含量顯著增加。這說明，皮蛋可以通過上調(diào)細(xì)胞促凋亡因子和下調(diào)細(xì)胞抗凋亡因子達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的目的，這種作用可能和Bcl-2/Bax以及caspase通路相關(guān)。
　　(4)為了進(jìn)一步了解皮蛋消化產(chǎn)物中抗腫瘤活性成分，探討其在功能食品上的可行性，對它的消化產(chǎn)物進(jìn)行

7、了深入的分離純化研究。首先通過多級分離純化的方法，得到了兩種皮蛋消化混合物的單一組分，分子量為10kDa以上。將抗腫瘤藥物5-FU作為陽性對照，以HT-29細(xì)胞為研究對象，實驗結(jié)果顯示，皮蛋各組分均能夠上調(diào)細(xì)胞促凋亡因子CytC、caspase-3和casase-9的含量并且促進(jìn)HT-29細(xì)胞凋亡。該促凋亡因子與線粒體通路密切相關(guān)。值得注意的是，皮蛋消化混合物的效果要優(yōu)于單一組分的效果。因此，皮蛋可能是通過混合物的相互作用共同達(dá)到抗腫瘤