電刺激小腦頂核（FNS）對大鼠局灶腦缺血-再灌注后腦內成體神經干細胞增殖、遷移的影響.pdf

1、背景腦血管病以其高發(fā)病率和高致殘率成為當前嚴重威脅人類健康的一類重要疾病，其中以缺血性腦血管病為最常見。大腦中動脈閉塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)是缺血性腦血管病中最常見的一種，治療的關鍵在于挽救缺血半暗帶瀕臨死亡的神經元和促進損傷后神經功能的恢復，但目前在臨床上能得到普遍公認的治療方法相當缺乏，且絕大多數(shù)藥物的I臨床療效均不理想。神經干細胞(neuralstemcell，NSC)的發(fā)現(xiàn)并體外

2、培養(yǎng)成功，為中樞神經系統(tǒng)(centralnervoussystem，CNS)功能重建和神經再生提供了新的思路。目前已公認的兩個神經發(fā)生(neurogenesis)區(qū)域為側腦室外側壁的腦室下區(qū)(subventricularzone，SVZ)和海馬齒狀回(dentategyrus，DG)的顆粒下層(subgranularlayer，SGL)，另外在哺乳動物的脊髓、隔區(qū)、紋狀體也分離出了神經干細胞。這預示著神經干細胞廣泛存在于成年哺乳動物的中

3、樞神經系統(tǒng)，能不斷地產生新的神經元與膠質細胞，為治療和治愈腦缺血提供了可能。 成年腦內神經干細胞在正常情況下大多處于靜息狀態(tài)，只有在某些因素作用下或者受到損傷刺激時，神經干細胞才被激活，重新進入細胞增殖周期，在趨化因子的作用下向損傷部位遷移，并進一步分化為特定功能的神經細胞。研究表明，神經干細胞的生存與其所在的“小生境(niche)”密切相關，神經營養(yǎng)因子、神經遞質、細胞黏附分子和趨化因子等許多因素都參與了神經再生過程。

4、 近十多年來，國內外學者研究發(fā)現(xiàn)電刺激小腦頂核(fastigialnucleusstimulation，F(xiàn)NS)可產生廣泛的神經保護作用，由此引出了“條件性中樞神經源性神經保護(conditionedcentralneurogenicneuroprotection，CCNN)"的概念；并圍繞CCNN保護機制進行了一系列研究，尤其借助于經典的神經生理學方法、神經核團毀損術、神經纖維示蹤術，結合現(xiàn)代分子生物學、免疫組織化學、免疫細胞化學等技

5、術，研究取得了重要的成果。臨床觀察到，‘‘電刺激小腦頂核(FNS)"治療后，腦卒中患者已損失的神經功能部分恢復，是否與內源性神經干細胞的激活有關，目前尚無這方面報道。基于上述理由，本課題將著重研究局灶缺血／再灌注后及電刺激小腦頂核(FNS)干預下側腦室室下帶(SVZ)、海馬齒狀回(DG)神經干細胞的增殖、遷移，初步探討FNS在腦組織重建中的作用和地位及利用內源性神經干細胞進行“補充治療”的細胞和分子機制。 目的(1)研究成年大鼠

6、局灶腦缺血／再灌注及電刺激小腦頂核(FNS)后缺血側側腦室和海馬的成體神經干細胞增殖情況；(2)初步明確成年大鼠局灶腦缺血／再灌注及電刺激小腦頂核(FNS)后缺血側側腦室和海馬成體神經干細胞遷移的軌跡；(3)了解成年大鼠局灶腦缺血／再灌注后及電刺激小腦項核(FNS)后缺血側側腦室和海馬bFGFmRNA、BDNFmRNA的表達水平，以了解神經干細胞增殖的機制。 方法雄性Wistar大鼠180只，通過改良線栓法制備大腦中動脈局灶腦缺

7、血1h/再灌注模型，隨機分為正常對照組(NC組)，假手術組(SC組)，單純缺血／再灌注組(I／R組)，缺gn／再灌注+小腦頂核假刺激組(I／RFs組)，缺血／再灌注+小腦項核刺激(I／RF)組。根據(jù)再灌注時間的不同又分為1d、3d、7d、14d、21d、28d6個亞組，每個亞組動物數(shù)n=6只。在ld、2d、6d、13d、20d、27d時腹腔注射Brdu來標記增殖的細胞。根據(jù)Wistar大鼠腦立體定向圖譜結合鼠的大小確定小腦頂核的適當位置

8、，用三通道電子刺激器于局灶腦缺血1h/再灌注后立即作連續(xù)刺激，刺激時間為1h。 通過TTC染色和HE染色來了解局灶腦缺血／再灌注后腦組織的病理學變化；通過免疫組化動態(tài)檢測側腦室和海馬區(qū)域Brdu陽性細胞和Nestin陽性細胞隨時間點和干預手段不同的表達變化；通過原位雜交動態(tài)檢測側腦室和海馬區(qū)域bFGFmRNA、BDNFmRNA隨時間點和干預手段不同的表達變化，加深對神經發(fā)生機制的理解。通過顯微圖像分析系統(tǒng)對陽性結果進行分析。

9、 結果(1)電刺激小腦項核(FNS)使腦梗塞灶體積明顯減小。(2)Brdu免疫組化結果：NC組和SC組側腦室和海馬區(qū)只存在少量Brdu陽性細胞，局灶腦缺血／再灌注后缺血側側腦室和海馬區(qū)Brdu陽性細胞呈現(xiàn)出單峰變化趨勢，即1d時開始增加(P<0．05)，3d時增加明顯(P<0．01)，到7d達一小峰值(P<0．01)，14d后迅速下降(P<0．01)，28d時已明顯下降(P<0．05)；FN假刺激組(I／RFs組)與I／R組變化相似

10、，各對應時間點比較差異無顯著性(P>0．05)；而局灶腦缺血／再灌注后再給予FNS(I／RF組)，上述兩個區(qū)域Brdu陽性細胞增殖更加明顯，1d時開始增加(P<0．05)，3d時明顯增加(P<0．01)，7d達峰值(P<0．01)，峰值更高，14d后緩慢下降(P<0．01)，28d時已明顯下降(P<0．05)，與NC組和SC組各對應時間點比較，差異有極顯著性(P<0．01)，與UR組和I／RFS組在1d、3d、7d、14d時間點比較，差

11、異有極顯著性(P<0．01)，在21d、28d時間點比較，差異有顯著性(P<0．05)。局灶腦缺血／再灌注還誘發(fā)Brdu陽性細胞發(fā)生遷移，而FNS后Brdu陽性細胞遷移更加明顯，細胞更稠密，距離更遠，形成長尾狀陽性細胞鏈，同時缺血紋狀體內Brdu陽性細胞逐漸增多。(2)Nestin免疫組化結果：NC組和SC組側腦室和海馬區(qū)只存在少量Nestin陽性細胞，局灶腦缺血／再灌注后缺血側側腦室和海馬區(qū)Nestin陽性細胞也呈現(xiàn)出單峰變化趨勢，即

12、1d時開始增加(P<0．05)，3d時增加明顯(P<0．01)，到7d達峰值(P<0．01)，14d后迅速下降(P<0．01)，28d時已明顯下降(P<0．05)；I／RFs組與I／R組變化相似，各對應時間點比較差異無顯著性(P>0．05)；而局灶腦缺血／再灌注后再給予FNS，上述兩個區(qū)域Nestin陽性細胞增殖更加明顯，1d時開始增加(P<0．05)，3d時增加明顯(P<0．01)，7d達峰值(P<0．01)，峰值更高，14d后緩慢下

13、降(P<0．01)，28d時已明顯下降(P<0．05)，與NC組和SC組各對應時間點比較，差異有極顯著性(P<0．01)，與I／R組和I／RFs組在1d、3d、7d、14d時間點比較，差異有極顯著性(P<0．01)，在2ld、28d時間點比較，差異有顯著性(P<0．05)。(3)bFGFmRNA原位雜交結果：正常腦組織中bFGFmRNA表達廣泛，但表達較弱；局灶腦缺血／再灌注后，缺血側側腦室和海馬區(qū)均可見bFGFmRNA的陽性表達增加(

14、P<0．05)，3d時明顯增加(P<0．01)，7d達一小高峰(P<0．01)，14d后迅速下降，28d時已明顯下降，略高于正常水平(P<0．05)；而局灶腦缺血／再灌注后再給予FNS，1d時bFGFmRNA~口明顯增加(P<0．01)，3d時增加更明顯(P

15、降，略高于I／R組和I／RFs組(P

16、5)；局灶腦缺血／再灌注后再給予FNS，ld時即明顯增加(P<0．01)，3d時增加更明顯(P<0．01)，7d達到高峰(P<0．01)，維持到14d(紋狀體區(qū)14d較7dP>0．05)，然后逐漸緩慢下降，21d時仍明顯高于其余各組(P<0．01)，28d時明顯下降，略高于I／R組和I／RFs組(P<0．05)，但仍明顯高于正常水平(P<0．01)。 結論(1)電刺激小腦頂核(FNS)能使梗塞灶體積減?。?2)局灶缺血／再灌注可

17、激活成體腦內側腦室和海馬區(qū)域的神經干細胞發(fā)生增殖、遷移；(3)電刺激小腦頂核(FNS)能使局灶腦缺血／再灌注后成體腦內側腦室和海馬區(qū)域的神經干細胞發(fā)生增殖更加明顯；(4)電刺激小腦頂核(FNS)能促進局灶腦缺血／再灌注后成體腦內側腦室和海馬區(qū)域的神經干細胞遷移數(shù)量更多，遷移的距離更長；(5)局灶腦缺血／再灌注可誘導成體腦內bFGFmRNA、BDNFmRNA反應增加、表達增高，但表達時程較短暫；(6)電刺激小腦項核(FNS)能使局灶腦缺血