RNA氧化損傷檢測方法優(yōu)化及不同條件下細胞RNA氧化損傷分析.pdf

1、目的:RNA是細胞內(nèi)廣泛分布的一類生物大分子,在基因表達調(diào)控、蛋白質(zhì)翻譯等方面發(fā)揮重要作用。研究表明在生理和病理條件下都存在RNA損傷,但卻一直沒有得到足夠重視,致使RNA損傷對細胞和機體造成的毒害作用被低估。最近有研究表明 RNA損傷可能參與神經(jīng)退行性疾病等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展,因此對RNA損傷的認識和研究將有助于對疾病發(fā)生機制的理解,并進一步為相關疾病的診斷和治療提供理論基礎和方法。本研究旨在建立并優(yōu)化細胞RNA氧化損傷的檢測方法,

2、分析不同條件下細胞和組織的RNA損傷狀況,并探索毛細血管擴張性共濟失調(diào)征突變蛋白(ATM)在RNA損傷識別和修復機制中的作用。
　　方法:反轉錄阻斷聯(lián)合雙引物擴增法:用過氧化氫(H2O2)處理非細胞體系和細胞體系RNA,反轉錄成cDNA,根據(jù)所檢測 mRNA的5'端和3'端各設計一對引物,進行實時定量PCR,比較兩端PCR產(chǎn)物相對含量判斷RNA氧化損傷程度,損傷越嚴重則反轉錄生成完整cDNA的效率越低,相應包含mRNA5'端的cD

3、NA含量越少。競爭性酶聯(lián)免疫法(ELISA):以 RNA主要氧化損傷產(chǎn)物8-羥基鳥嘌呤(8-OHG)作為競爭性抗原包被于酶標板內(nèi),與RNA損傷樣品競爭性結合特異性抗體,通過測量酶標板內(nèi)各孔OD450判斷RNA損傷狀況。采用ELISA方法檢測ATM野生型和突變型細胞RNA氧化損傷;將非氧化和H2O2氧化處理的RNA轉染人胚腎293細胞,用Western blotting檢測ATM磷酸化及蛋白表達水平變化。
　　結果:以管家基因甘油醛

4、-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和p53 mRNA為檢測對象,應用反轉錄阻斷聯(lián)合雙引物擴增法檢測出非細胞體系和細胞體系氧化處理組mRNA損傷程度均明顯高于對照組,且隨著氧化劑H2O2濃度增加損傷增強,同時一定限度內(nèi)降低反轉錄酶用量能提高檢測靈敏度。競爭性ELISA法檢測到癌與癌旁組織、細胞衰老模型中存在氧化損傷RNA;同時檢測出HeLa細胞經(jīng)電離輻射后產(chǎn)生RNA氧化損傷,且損傷程度與輻射劑量成正相關。ATM突變型細胞較野生型細胞其 RNA