氧化應(yīng)激條件下SOCE對(duì)EPCs細(xì)胞活性及凋亡影響的研究.pdf

1、背景及目的:既往研究表明，血管內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)形成的起始因素，其修復(fù)有利于延緩AS的進(jìn)展，因此，如何有效地修復(fù)受損的血管內(nèi)皮便成了AS防治研究的焦點(diǎn)。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)具有分化為內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)，促進(jìn)血管形成的能力，因此已經(jīng)受到人們的廣泛關(guān)注。近年來的研究發(fā)現(xiàn)雖然輸注EPCs到動(dòng)物體內(nèi)可以有效延緩AS進(jìn)程，但仍然存在著輸注到體內(nèi)的細(xì)胞生存能力低下的問題。AS進(jìn)程受多種因素影響，其中大多數(shù)因素能夠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，而它又直

2、接或者間接促進(jìn)ECs及內(nèi)皮受損，觸發(fā)AS的發(fā)生且貫穿整個(gè)AS過程。另外有文獻(xiàn)報(bào)道稱氧化應(yīng)激能夠?qū)е翬PCs增殖、分化、遷移及粘附等能力的降低，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，因此提高EPCs在氧化應(yīng)激條件下的生存能力則可能為細(xì)胞療法治療AS提供一種保障。
　　鈣庫(kù)操縱型鈣內(nèi)流(SOCE)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞尤其非興奮細(xì)胞是普遍存在的一種Ca2+內(nèi)流方式。SOCE由鈣庫(kù)操縱型Ca2+通道(SOCC)介導(dǎo)且在多種疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)室前期

3、研究發(fā)現(xiàn)EPCs上存在SOCE，改變SOCC的主要組成蛋白能夠影響細(xì)胞的增殖、分化、遷移及粘附等功能。但是SOCE是否參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的EPCs損傷尚未見報(bào)道，另外越來越多的證據(jù)表明胞內(nèi)Ca2+濃度和Ca2+信號(hào)通路與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。
　　因此，本研究擬利用過氧化氫(H2O2)作為氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)劑處理EPCs，探索SOCE在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的EPCs損傷中可能發(fā)揮的作用以及相關(guān)機(jī)制，并嘗試尋找減緩甚至逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)EPCs損傷的靶

4、點(diǎn)及策略。
　　方法:
　　1.H2O2對(duì)EPCs細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡的影響
　　1.1 EPCs的分離接種、培養(yǎng)及鑒定
　　取雄性SD大鼠，150-180 g，腹腔注射過量的戊巴比妥鈉(100μ g/kg)處死，經(jīng)碘伏消毒后解剖取脾臟，接著梯度離心法分離獲取單個(gè)核細(xì)胞并接種至低糖型培養(yǎng)基中。以培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)至7天，培養(yǎng)過程中用顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁情況及細(xì)胞形態(tài)變化，符合EPCs特征并用DiI-Ac-LDL和

5、FITC-UEA-I熒光雙吞法檢測(cè)細(xì)胞是否具備EC特性。
　　1.2 H2O2對(duì)細(xì)胞活性的影響
　　EPCs培養(yǎng)7天，用胰蛋白酶消化后接種至96孔板，待細(xì)胞貼壁后H2O2處理，cck8檢測(cè)細(xì)胞活性。
　　1.3 H2O2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
　　EPCs培養(yǎng)7天，H2O2處理細(xì)胞，凋亡相關(guān)試劑染色后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)EPCs凋亡情況。
　　2.H2O2對(duì)胞內(nèi)Ca2+流、SOCE及SOCC復(fù)合體的影響
　　2

6、.1 H2O2對(duì)胞內(nèi)鈣流的影響
　　2.1.1 EPCs培養(yǎng)7天，避光孵育Fluo-3AM，H2O2處理后觀察細(xì)胞內(nèi)鈣流變化。
　　2.1.2 EPCs培養(yǎng)7天，Ca2+螯合劑(BAPTA)預(yù)處理，H2O2處理后cck-8及凋亡試劑盒分別檢測(cè)細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡情況。
　　2.2 H2O2對(duì)SOCE的影響
　　EPCs培養(yǎng)7天，為了探討H2O2誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+濃度變化是否由SOCE引起的，避光孵育Fluo-3AM

7、，觀察無細(xì)胞外Ca2+存在情況下，H2O2和毒胡蘿卜素(TG)處理，激光共聚焦顯微鏡下觀察此時(shí)及Ca2+濃度回落后加入CaCl2溶液細(xì)胞內(nèi)鈣流變化。
　　2.3 H2O2對(duì)SOCC復(fù)合體的影響
　　2.3.1 EPCs培養(yǎng)7天，提取總RNA，半定量PCR觀察SOCC復(fù)合體主要組成成分（Orai1、Stim1、Trpc1）轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　2.3.2 EPCs培養(yǎng)7天，提取總蛋白，BCA法測(cè)量蛋白濃度，Western

8、 blot檢測(cè)翻譯水平SOCC復(fù)合體主要組成蛋白（Orai1、Stim1、Trpc1）的改變。
　　2.4 抑制SOCE后觀察H2O2對(duì)胞內(nèi)鈣濃度的影響
　　2.4.1 shRNA干擾Stim1的表達(dá)
　　EPCs培養(yǎng)5天，貼壁好，融合度大約30-50％，用攜帶shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染2天，熒光顯微鏡觀察并用免疫印跡法分析干擾效度。
　　2.4.2 抑制SOCE對(duì)H2O2誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流的影響
　　藥物抑制及sh

9、RNA干擾EPCs后，孵育裝載Fluo-3AM，HBSS溶液洗去培養(yǎng)液中殘留的Fluo-3AM，H2O2處理并在顯微鏡下觀察Ca2+實(shí)時(shí)變化情況。
　　3.H2O2增強(qiáng)SOCE對(duì)細(xì)胞活性及凋亡的影響
　　SOCE抑制劑抑制及shStim1干擾EPCs來抑制SOCE，H2O2處理細(xì)胞后分別用cck-8和凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性及凋亡情況。
　　4.H2O2通過SOCE引起細(xì)胞凋亡機(jī)制的探討
　　4.1 抑制SOCE對(duì)

10、胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的影響
　　培養(yǎng)EPCs，ML-9預(yù)處理或shRNA干擾抑制SOCE后加H2O2處理6小時(shí)，對(duì)比觀察細(xì)胞凋亡情況。
　　4.2 抑制SOCE對(duì)caspase家族的影響
　　培養(yǎng)EPCs7天，H2O2處理并用免疫印跡法分析其對(duì)caspase家族蛋白的表達(dá)情況的影響，針對(duì)有明顯變化的caspase家族蛋白，抑制SOCE后觀察H2O2處理對(duì)蛋白表達(dá)的影響。
　　4.3 抑制SOCE對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水

11、平及線粒體損傷水平的影響
　　觀察發(fā)現(xiàn)H2O2處理EPCs能夠顯著上調(diào)caspase9和caspase12蛋白的表達(dá)水平，這說明H2O2處理可能觸發(fā)了與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體功能紊亂相關(guān)的凋亡途徑，為了進(jìn)一步證實(shí)這一推論，用H2O2處理EPCs，免疫印跡法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性表達(dá)蛋白CHOP、BIP及線粒體功能紊亂標(biāo)志蛋白cytochrome C的表達(dá)變化，并觀察線粒體膜電位變化情況。以及抑制SOCE后加H2O2處理同樣檢測(cè)這些指標(biāo)，

12、觀察其對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平及線粒體損傷水平的影響。
　　結(jié)果:
　　1.H2O2對(duì)EPCs細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡的影響
　　1.1 EPCs的分離接種、培養(yǎng)及鑒定
　　分離獲取脾源性EPCs并接種至低糖型培養(yǎng)基上，期間在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞逐漸增大變變圓，最終呈現(xiàn)梭狀、紡錘狀、樹突狀等各種形狀。熒光雙吞法鑒定顯示，DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-I雙陽性的細(xì)胞大概有85％，這些即為EPCs。
　　1

13、.2 H2O2對(duì)細(xì)胞活性的影響
　　不同濃度H2O2處理EPCs6小時(shí)，cck-8檢測(cè)細(xì)胞活性顯示200μMH2O2時(shí)細(xì)胞活性顯著降低(p＜0.05)，600μM時(shí)細(xì)胞活性接近50％。用600μM H2O2處理不同時(shí)間發(fā)現(xiàn)1小時(shí)后細(xì)胞活性明顯降低(p＜0.05)，6小時(shí)時(shí)細(xì)胞活性降至50％左右。因此600μM H2O2處理6小時(shí)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)條件。
　　1.3 H2O2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
　　600μMH2O2處理E

14、PCs6小時(shí)，凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示，細(xì)胞凋亡明顯增加(p＜0.05)，而且對(duì)照組和H2O2處理組細(xì)胞凋亡率分別為5.30％和40.65％。
　　2.H2O2對(duì)胞內(nèi)Ca2+流、SOCE及SOCC復(fù)合體的影響
　　2.1 H2O2對(duì)胞內(nèi)鈣流的影響
　　2.1.1 EPCs培養(yǎng)7天，避光孵育Fluo-3 AM，600μM H2O2處理并在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入H2O2后胞內(nèi)Ca2+濃度迅速升高。

15、　　2.1.2 為了進(jìn)一步探討H2O2、Ca2+濃度與細(xì)胞活性及凋亡的關(guān)系，首先利用胞內(nèi)Ca2+螯合劑(BAPTA)預(yù)處理EPCs，再用600μM H2O2處理6小時(shí)，cck-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)可以顯著減緩H2O2造成的EPCs活性的降低(p＜0.05)，與此同時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明H2O2造成的EPCs凋亡增加的狀況也得到顯著改善(p＜0.05)。
　　2.2 H2O2對(duì)SOCE的影響
　　為了探討H2O2是否通過SOCE誘導(dǎo)

16、胞內(nèi)Ca2+的改變，避光孵育Fluo-3AM后，HBSS溶液洗脫細(xì)胞外Ca2+，H2O2和TG處理EPCs發(fā)現(xiàn)H2O2處理與TG一樣能夠誘導(dǎo)典型的鈣釋放激活鈣內(nèi)流的過程。
　　2.3 H2O2對(duì)SOCC復(fù)合體的影響
　　實(shí)驗(yàn)表明H2O2處理能夠引起SOCE的變化，為了進(jìn)一步探討H2O2引起SOCE改變的機(jī)制，我們分別在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平檢測(cè)SOCC復(fù)合體組成成分（Orai1、Stim1、Trpc1）的改變，結(jié)果顯示與對(duì)照組相

17、比轉(zhuǎn)錄水平Orai1下調(diào)、Stim1上調(diào)、Trpc1下調(diào)，翻譯水平Orai1下調(diào)39.77％(p＜0.05)、Stim1上調(diào)122.03％(p＜0.05)、Trpc1無明顯變化(p＞0.05)。
　　2.4 抑制SOCE后觀察H2O2對(duì)胞內(nèi)鈣濃度的影響
　　2.4.1 針對(duì)H2O2引起改變的SOCC復(fù)合體主要組成成分，選取干擾Stim1來特異性抑制SOCE，熒光顯微鏡下觀察近一半細(xì)胞攜帶熒光，免疫印跡法結(jié)果表明ShRNA干擾

18、能夠下調(diào)Stim1蛋白表達(dá)達(dá)30.15％(p＜0.05)。
　　2.4.2 SOCE抑制劑(ML-9)預(yù)處理及ShRNA干擾Stim1后，600μ MH2O2處理6小時(shí)觀察EPCs胞內(nèi)Ca2+濃度變化，結(jié)果顯示抑制SOCE能夠明顯降低H2O2誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+濃度升高。
　　3.H2O2增強(qiáng)SOCE對(duì)細(xì)胞活性及凋亡的影響
　　抑制SOCE后600μM H2O2處理6小時(shí)cck-8檢測(cè)細(xì)胞活性及凋亡試劑盒檢測(cè)凋亡發(fā)現(xiàn)，與

19、H2O2組相比ML-9組和ShRNA干擾組細(xì)胞活性分別升高20.04％(p＜0.05)和27.68％(p＜0.05)，細(xì)胞凋亡分別降低16.45％(p＜0.05)和23.34％(p＜0.05)。
　　4.H2O2通過SOCE引起細(xì)胞凋亡機(jī)制的探討
　　4.1 抑制SOCE對(duì)胞內(nèi)ROS水平的影響
　　600μM H2O2處理6小時(shí)，胞內(nèi)ROS水平明顯升高(p＜0.05)，而用胞內(nèi)ROS清除劑預(yù)處理組則細(xì)胞凋亡減少18.5

20、49％(p＜0.05)，說明ROS水平的升高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，那么抑制SOCE所減緩的H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否跟胞內(nèi)ROS水平相關(guān)呢？進(jìn)一步我們抑制SOCE發(fā)現(xiàn)抑制SOCE可以明顯降低H2O2誘導(dǎo)的胞內(nèi)ROS水平的升高(p＜0.05)。
　　4.2 抑制SOCE對(duì)caspase家族的影響
　　為了探索H2O2通過SOCE誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，首先檢測(cè)H2O2對(duì)caspase家族的影響，結(jié)果顯示它可以明顯促進(jìn)caspase家

21、族成員9和12表達(dá)的上調(diào)(p＜0.05)。
　　4.3 抑制SOCE對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平及線粒體損傷水平的影響
　　600μM H2O2處理6小時(shí)，能夠明顯上調(diào)caspase家族成員9和12的蛋白表達(dá)水平，說明H2O2處理可能激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑和線粒體損傷凋亡途徑，為了進(jìn)一步證實(shí)這一推論，我們檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體損傷相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示H2O2明顯上調(diào)CHOP、BIP及cytochrome C的表達(dá)(p＜0.05)，降低線

22、粒體膜電位(p＜0.05)，說明H2O2上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平及線粒體損傷水平。而抑制SOCE可以明顯降低H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平及線粒體損傷水平的升高(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.H2O2促進(jìn)EPCs細(xì)胞活性的降低及細(xì)胞凋亡的增加。
　　2.H2O2促進(jìn)EPCs上SOCE的增強(qiáng)。
　　3.H2O2部分通過上調(diào)Stim1的表達(dá)增強(qiáng)SOCE。
　　4.H2O2通過增強(qiáng)SOCE促進(jìn)EPCs細(xì)胞活性的降