痤瘡丙酸桿菌活菌誘導(dǎo)單核細(xì)胞系THP—1細(xì)胞因子表達(dá)及反應(yīng)氮中間產(chǎn)物系統(tǒng)殺傷作用的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)選用來源于人急性單核細(xì)胞性白血病的單核細(xì)胞系THP-1，研究單核細(xì)胞在被P.acnes活菌刺激后的早期天然免疫階段，趨化性細(xì)胞因子IL-8，調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL-10、IL-12，促炎細(xì)胞因子TNF-α和RNI系統(tǒng)中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)、NO及自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白1(naturalresistanceassociated-macrophageprotein1，N

2、ramp1)表達(dá)量的變化，探討天然免疫系統(tǒng)中單核-巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)及反應(yīng)氮中間產(chǎn)物(reactivenitrogenintermediate，RNI)系統(tǒng)殺傷作用的時(shí)相變化規(guī)律。 第一部分：痤瘡丙酸桿菌活菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α的表達(dá)。 通過使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR△Ct定量法，觀察P.acnes活菌刺激人源性單核細(xì)胞系THP-1后不同時(shí)段細(xì)胞因子IL-8、IL-10、IL-12

3、、TNF-α的表達(dá)水平，探討P.acnes活菌誘導(dǎo)THP-1表達(dá)細(xì)胞因子的時(shí)相規(guī)律。結(jié)果顯示： 1.P.acnes活菌刺激后6hIL-8即達(dá)到高峰(P＜0.05)，到24h開始降低，72h后仍維持較高水平，說明與其他細(xì)菌感染一樣，IL-8趨化大量中性粒細(xì)胞，參與天然免疫系統(tǒng)針對(duì)P.acnes感染的早期免疫應(yīng)答，這與早期痤瘡病理學(xué)特點(diǎn)中大量中性粒細(xì)胞聚集的表現(xiàn)相符合。 2.IL-10、IL-12表達(dá)量均在刺激后24-48h

4、達(dá)到高峰(P＜0.05)，72h后開始逐漸下降，提示在IL-12升高的同時(shí)，作為對(duì)炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控，IL-10也開始表達(dá)，而且二者表達(dá)量變化的趨勢(shì)一致，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡和NK、LAK細(xì)胞活性，在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)殺傷P.acnes的同時(shí)減少對(duì)機(jī)體的損傷。 3.TNF-α在刺激后6h到達(dá)高峰(P＜0.05)，48h后明顯降低，提示單核細(xì)胞在P.acnes感染早期表達(dá)TNF-α，促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞的增殖，活化單核-巨噬細(xì)胞，提高

5、中性粒細(xì)胞的吞噬能力，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。 上述結(jié)果說明，在針對(duì)P.acnes感染的天然免疫早期應(yīng)答階段，單核細(xì)胞即通過Toll樣受體(TLRs)等模式識(shí)別受體識(shí)別P.acnes，表達(dá)IL-8、IL-12、TNF-α，進(jìn)一步刺激單核-巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK、LAK、CTL等免疫細(xì)胞分化增殖和相關(guān)促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，并且誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。這些細(xì)胞因子的表達(dá)，一方面殺傷P.acnes，另一方面也引起皮損局部血管擴(kuò)張、血管通透

6、性增加、各種炎癥細(xì)胞聚集，從而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，皮損表現(xiàn)為紅腫、丘疹及膿皰。同時(shí)，IL-10也開始對(duì)炎癥反應(yīng)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，控制炎癥反應(yīng)的程度，避免過度炎癥反應(yīng)造成的損傷。提示IL-8、IL-12p40、TNF-α是P.acnes感染后肉芽腫性病理表現(xiàn)形成的重要因素之一。 第二部分：痤瘡丙酸桿菌活菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞iNOS、NO及Nrampl的表達(dá)。 通過使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR△Ct定量法，觀察P.acnes活菌刺激人源性單核

7、細(xì)胞系THP-1后不同時(shí)段iNOS、Nrampl的表達(dá)水平，通過Griess比色法檢測(cè)培養(yǎng)液上清中NO的含量，探討P.acnes活菌誘導(dǎo)THP-1產(chǎn)生活性氮中間產(chǎn)物相關(guān)因子的時(shí)相規(guī)律。結(jié)果顯示： 1.iNOS表達(dá)量在刺激后6h即顯著增加(P＜0.01)，維持到48小時(shí)開始降低，而NO濃度在刺激后6h即顯著升高(P＜0.01)，到72h時(shí)仍維持較高水平，說明在P.acnes感染早期，單核—巨噬細(xì)胞系統(tǒng)就能作出反應(yīng)，同時(shí)iNOSmR

8、NA表達(dá)的高峰時(shí)段要比細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量高峰出現(xiàn)得早，而上清中NO濃度可在較高水平保持到72h，可能是因?yàn)閕NOS的生物學(xué)活性可以維持96至120h，NO在培養(yǎng)液中積累所致。 2.Nrampl表達(dá)量在刺激后6h開始顯著增加(P＜0.01)，維持到48h開始降低，說明Nrampl作為二價(jià)陽離子泵，在P.acnes感染瞬時(shí)免疫應(yīng)答階段即參與天然免疫過程，對(duì)RNI反應(yīng)系統(tǒng)發(fā)揮輔助作用上述結(jié)果說明，天然免疫中的RNI反應(yīng)系統(tǒng)在P.ac

9、nes感染的初期即參加免疫反應(yīng)，Nrampl在RNI系統(tǒng)啟動(dòng)的同時(shí)也開始參與早期的天然免疫反應(yīng)，可能意味著該系統(tǒng)可以抑制P.acnes產(chǎn)生抵抗NO殺傷的酶。 綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR△Ct定量法、Griess比色法，發(fā)現(xiàn)在P.acnes活菌刺激后，人源性單核細(xì)胞系THP-1在早期免疫應(yīng)答階段細(xì)胞因子IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α和RNI系統(tǒng)中iNOS、NO及Nrampl蛋白表達(dá)量顯著增加。說明細(xì)

10、胞因子IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α在單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)高峰主要在早期免疫應(yīng)答階段，96h后主要是由適應(yīng)性免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生，提示P.acnes能夠通過這些細(xì)胞因子引起肉芽腫樣改變。在針對(duì)P.acnes感染的早期免疫應(yīng)答階段，單核-巨噬細(xì)胞的RNI系統(tǒng)可以一直保持較高的非特異殺傷作用，為了抑制細(xì)菌產(chǎn)生抗RNI的酶類，二價(jià)陽離子通道蛋白Nrampl也同時(shí)表達(dá)，從而在由天然免疫到適應(yīng)性免疫的過渡過程中，保持對(duì)細(xì)菌的殺傷抑制