Cpn0810基因克隆與表達及誘導THP-1細胞產生前炎癥細胞因子和凋亡的研究.pdf

1、目的：構建重組質粒pGEX6p-2/Cpn0810，在E.coli BL21中進行誘導表達，純化獲得重組融合蛋白Cpn0810。研究該重組蛋白在體外誘導人單核細胞產生前炎癥細胞因子TNF-α和IL-6的水平及誘導細胞凋亡的作用，為進一步探索Cpn感染致病的分子機制提供實驗依據。
　　方法：PCR擴增Cpn0810蛋白編碼基因，構建pGEX6p-2/Cpn0810重組質粒，測序正確后在E.coli BL21中誘導表達，用SDS-PA

2、GE和Western-Blot進行分析和鑒定。用ToxinEraser純化柱去除內毒素后用不同濃度的GST-Cpn0810刺激THP-1細胞；ELISA法檢測經刺激后的THP-1細胞產生的TNF-α和IL-6水平；以 WST-1法檢測經 GST-Cpn0810處理后對 THP-1細胞的增生或抑制作用；用Hoechst33258熒光染色、AnnexinV-FITC-PI染色法檢測細胞凋亡情況。
　　結果：構建了重組質粒pGEX6p-

3、2/Cpn0810，并在E.coli BL21菌中高效表達出Mr約為42kDa的GST-Cpn0810目的蛋白，超聲裂解后SDS-PAGE分析目的蛋白在菌體細胞內以可溶性形式表達，經采用默克Novagen的GST純化樹脂純化獲得純度在95％以上的重組蛋白。GST-Cpn0810能誘導THP-1細胞表達TNF-α和IL-6，并以時間、劑量依賴方式刺激細胞分泌前炎癥細胞因子TNF-α和IL-6，當 GST- Cpn0810的濃度為4μg/m

4、L時產生的TNF-α和IL-6量最多，分別為（184.75±17.40）pg/mL、（75.36±29.49）pg/mL；當 GST-Cpn0810刺激 THP-1細胞24h時產生的TNF-α和IL-6量則達到高峰。另外GST-Cpn0810以劑量依賴方式抑制THP-1細胞增殖。當10μg/mL GST-Cpn處理THP-1細胞24h后，形態(tài)學上，細胞表現為皺縮、核碎裂、細胞起泡及凋亡小體等凋亡特征。
　　結論：
　　1.成