炎癥、糖基化終末產物、葡萄糖及胰島素對單核-巨噬細胞系THP-1細胞功能的影響.pdf

1、背景與目的:近年來，糖尿病(diabetesmellitus，DM)的炎癥病因學理論倍受關注，該理論認為DM患者體內普遍存在慢性低度炎癥反應(Chroniclow-gradeinflammatorydisease)，并且這種低度炎癥反應還在進一步加重DM，并促進一些臨床并發(fā)癥的出現(xiàn)，具體表現(xiàn)在胰島素抵抗的加重、高血壓的惡化、動脈粥樣硬化等心血管疾病的出現(xiàn)以及慢性腎臟病的進展等。其中，巨噬細胞在天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的防御作用，而巨噬細

2、胞活化平衡也是決定炎癥轉歸的關鍵。在2型糖尿病發(fā)展過程中，高糖，高胰島素血癥及糖基化終末產物(advancedglycationendproduct，AGE)等微環(huán)境引起胰島素源性的炎性因子分泌增加，促使巨噬細胞活化分泌大量炎性因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等，加劇氧化應激，引起組織損傷。近來，旨在研究危重病人血糖控制的NICE-SUGAR研究及預防糖尿病心血管事件的ACCORD研究均沒有發(fā)現(xiàn)實現(xiàn)血糖正常化

3、可減少全因死亡。本實驗從慢性低度炎癥的視角出發(fā)，用人急性單核細胞白血病細胞株THP-1所誘導的巨噬細胞作為研究的模型，來研究不同葡萄糖、胰島素和AGE濃度狀態(tài)下及外源性炎性因子脂多糖對中性粒細胞的吞噬功能和ROS產量的影響，以探索炎癥狀態(tài)下AGE、葡萄糖、胰島素對單核細胞氧化應激及吞噬能力的影響。
　　 方法:
　　 1.細胞培養(yǎng)
　　 人類急性單核細胞白血病細胞株THP-1（由上海細胞庫提供）。將THP-1細胞

4、置入含有的10％胎牛血清的RPMI1640（5.0mmol/L葡萄糖）培養(yǎng)液中，放置于37℃，5％CO2的孵育箱中培養(yǎng)。并在對數生長期收獲細胞，使細胞達到同步化后加入不同的實驗處理因素。
　　 2.實驗分組
　　 (1)用終濃度為160nmmol/L的PMA誘導生長良好的THP-1細胞72h，使其分化成巨噬細胞。
　　 (2)本實驗分別用不同水平的葡萄糖濃度對THP-1細胞進行培養(yǎng)(5.0、8.0、10.0、15

5、.0、20.0和25mmol/L)，細胞于37℃，5％CO2的孵育箱中培養(yǎng)72h后，收獲細胞。
　　 (3)實驗各組細胞再分別用不同濃度的胰島素進行對抗(0mIU/L、20mIU/L、50mIU/L、200mIU/L和1000mIU/L)，細胞于37℃，5％CO2的孵育箱中培養(yǎng)24h后收獲細胞。
　　 (4)體外人工孵育AGE-BSA，以培養(yǎng)的THP-1細胞為模型，首先將細胞隨機分成兩組，第一組加入一定蛋白濃度的BSA（

6、終濃度為100ug/ml）作為對照組處理48h;第二組分別加入不同蛋白濃度的AGE-BSA(終濃度為50、100、200、400ug/ml)處理48h后收獲細胞。
　　 (5)實驗各組細胞置于有外源性炎癥刺激因子LPS（1μg/ml）和無LPS(0μg/ml)的條件中，刺激24h后收獲細胞，檢測THP-1細胞的吞噬的功能和氧化應激ROS產生的多少情況并進行多因素的析因設計方差分析進行組間及組內的比較，結果進行比較。
　　

7、 結果:
　　 1.葡萄糖、AGE、胰島素及LPS對THP-1細胞ROS釋放的影響
　　 (1)THP-1細胞產生ROS的能力從葡萄糖濃度5.0mmol/L至25.0mmol/呈上升的趨勢。
　　 (2)THP-1細胞產生ROS的能力從AGE濃度50mg/L至400.0mg/L呈逐步上升的趨勢。
　　 (3)THP-1細胞在胰島素濃度20.0mu/L與對照組相比，產生ROS的能力是降低的。從胰島素濃度20

8、.0mu/L至1000.0mu/L呈顯著上升的趨勢。
　　 (4)當培養(yǎng)液內有葡萄糖與1μg/ml脂多糖(LPS)共同培養(yǎng)時，細胞產生ROS的能力在各葡萄糖濃度均顯著增加，其中在15mmol/L的糖濃度水平ROS的釋放量達最高值。
　　 (5)當培養(yǎng)液內有胰島素與1μg/ml脂多糖(LPS)共同培養(yǎng)時，細胞產生ROS的能力在各胰島素濃度均顯著增加。
　　 (6)當培養(yǎng)液內有AGE與1μg/ml脂多糖(LPS)共同

9、培養(yǎng)時，細胞產生ROS的能力雖然和對照組比較是增加的，但是與LPS加入前沒有差異。
　　 2.葡萄糖、AGE、胰島素和LPS對THP-1細胞吞噬功能的影響
　　 (1)THP-1細胞吞噬功能從葡萄糖5.0mmol/L到10.0mmol/L無改變，但在葡萄糖15mmol/L時降至最低值，20mmol/L和25mmol/L的吞噬功能也較低。
　　 (2)THP-1細胞的吞噬能力在各AGE濃度較對照組有明顯的下降。

10、r>　　 (3)THP-1細胞吞噬功能從胰島素20mu/L和50mu/L無改變，但在200mu/L和1000mu/L的吞噬功能下降。
　　 (4)予1μg/ml脂多糖(LPS)刺激后，THP-1細胞的吞噬功能在葡萄糖濃度為5mmol/L時最強，細胞吞噬功能從葡萄糖濃度5.0mmol/L至20.0mmol/L雖較刺激前上升，但和5mmol/L比較升高并不明顯。(5)當培養(yǎng)液內有胰島素與1μg/ml脂多糖(LPS)共同培養(yǎng)時，細胞

11、產生吞噬能力能力均顯著增加。
　　 (6)予1μg/ml脂多糖(LPS)刺激后，細胞吞噬功能AGE濃度50mg/L至400.0mg/L普遍低下。
　　 結論:1.LPS與AGE均作為炎性因子刺激巨噬細胞活化，參與炎癥反應，加重血糖和胰島素對巨噬細胞功能影響過程。2.胰島素在生理濃度下，發(fā)揮其抗炎作用;但胰島素抵抗時的濃度，損傷細胞功能。3.通過本實驗數據觀察，5.0～10.0mmol/L血糖水平范圍可能是機體對血糖的最佳