RNF2抑制肝癌細胞的惡性生物學行為及其與MANF相互作用的研究.pdf

1、環(huán)指蛋白2（ring finger protein2，Ring2又稱RNF2或Ring1b）是一個具有環(huán)指（ring finger）結構的泛素連接酶（E3），屬于多梳蛋白家族（polycomb group，PcG）中多梳抑制子復合物1(polycomb repressor complex1,PRC1)中的一員，可介導組蛋白H2A的第119位賴氨酸的泛素化，從而影響染色質(zhì)的結構，具有基因轉(zhuǎn)錄抑制的作用。PcG家族中的很多蛋白都與腫瘤的發(fā)生

2、和發(fā)展具有密切聯(lián)系，而關于RNF2在肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中所起的作用及其具體機制仍不明確。RNF2作為一個通過酵母雙雜交篩選出的與中腦星形膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF）具有相互作用的蛋白，在HCC細胞和組織中也與MANF存在密切的相關性。MANF是一種可被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（Endopla

3、smic reticulum stress，ERS）所誘導的分泌性蛋白，我們的研究發(fā)現(xiàn)其對HCC也有抑制作用。而RNF2可劑量依賴性的調(diào)節(jié)MANF的蛋白水平，因此我們推測RNF2對HCC的抑制作用可能是通過與MANF的相互作用而實現(xiàn)。
　　目的：
　　1.觀測RNF2在人肝細胞癌及非癌組織中的表達及與病人預后的關系；
　　2.研究RNF2對肝癌細胞的影響；
　　3.證明RNF2和MANF的相互作用；
　　方

4、法：
　　在SMMC-7721細胞和TEL-7402細胞中，采用MTT實驗、流式細胞術、免疫印跡法檢測caspase-3等方法證明RNF2對肝癌細胞的增殖和凋亡的影響；用平板實驗、軟克隆瓊脂實驗、劃痕實驗、Transwell實驗等研究RNF2對肝癌細胞的抑制作用；采用細胞免疫熒光、組織免疫熒光、組織免疫共沉淀驗證RNF2和MANF在HCC中的相互作用；分別用tunicamycin（TM）和oxygen glucose depriv

5、ation（OGD）處理SMMC-7721和TEL-7402細胞，模擬HCC病人體內(nèi)的應激和缺糖缺氧狀態(tài)，在沉默和過表達RNF2之后，用RT-PCR和Western blot方法檢測MANF的基因和蛋白表達情況；在SMMC-7721細胞中分別轉(zhuǎn)染RNF2-myc質(zhì)粒（0μg，0.25μg，0.5μg，1.0μg），并分別用TM和OGD處理之后，用免疫印跡實驗檢測MANF的蛋白表達情況。
　　結果：
　　1. RNF2在人肝細

6、胞癌和非癌肝臟組織中的表達
　　用免疫組織化學技術檢測RNF2在150例的肝細胞癌病人和136例的非腫瘤對照肝臟組織中的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，RNF2在所有的病例中都有表達，且與非癌對照比較，肝細胞癌病人的肝臟組織中RNF2高表達的比率顯著下降（p<0.01）。
　　2. RNF2可以增加糖氧剝奪（OGD）處理后肝癌細胞的死亡
　　在SMMC-7721細胞中瞬時轉(zhuǎn)染RNF2的過表達質(zhì)粒以及siRNA，經(jīng)OGD處理2.5

7、h之后，用PI對其進行染色，對視野下紅色的PI陽性細胞進行計數(shù)，并進行統(tǒng)計分析。結果發(fā)現(xiàn)過表達RNF2之后，死亡細胞增加；沉默了RNF2之后，死亡細胞減少，提示RNF2可能會促進在缺糖缺氧情況下肝癌細胞的死亡。
　　3. RNF2促進SMMC-7721細胞的凋亡
　　SMMC-7721細胞中轉(zhuǎn)染RNF2-siRNA質(zhì)粒并經(jīng)過OGD處理，然后用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況，用免疫印跡技術檢測 caspase-3的表達情況。結果

8、RNF2可以促進OGD誘導的細胞凋亡及caspase-3的表達。
　　4. RNF2對HCC細胞惡性行為學的影響
　　4.1 RNF2抑制肝癌細胞的增殖
　　在SMMC-7721和TEL-7402細胞中分別轉(zhuǎn)染RNF2-siRNA和RNF-myc質(zhì)粒，用MTT法及克隆形成實驗，分別檢測各組細胞的OD值以及單個細胞克隆形成能力。結果發(fā)現(xiàn)在沉默RNF2之后，細胞的增殖能力增加，過表達RNF2使細胞的增殖能力減弱。用流式細胞

9、儀檢測細胞的活力也發(fā)現(xiàn)在沉默RNF2之后，細胞的增殖能力增加。
　　4.2 RNF2抑制肝癌細胞的遷移能力
　　用劃痕實驗觀測了分別轉(zhuǎn)染RNF2-siRNA和RNF2-myc質(zhì)粒的肝癌細胞的遷移能力。結果發(fā)現(xiàn)沉默了RNF2之后，細胞的遷移能力增強，而過表達RNF2使細胞的遷移能力減弱，該結果提示RNF2對肝癌細胞的遷移具有抑制作用。
　　4.3 RNF2對肝癌細胞的侵襲能力具有抑制作用
　　在分別沉默和過表達RN

10、F2的SMMC-7721和TEL-7402細胞中，用transwell實驗方法檢測細胞的侵襲能力，結果表明在沉默了RNF2的細胞組中，穿過T4小孔的細胞數(shù)比轉(zhuǎn)染載體對照的細胞增多；相反，過表達RNF2可抑制細胞的遷移，提示RNF2可以抑制肝癌細胞的侵襲能力。
　　5. RNF2和MANF在SMMC-7721細胞核中共定位
　　SMMC-7721細胞經(jīng)TM處理6 h或者經(jīng)OGD處理2.5 h之后，用免疫熒光雙標觀察RNF2和M

11、ANF的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞經(jīng)上述處理之后，MANF和RNF2在細胞核中共定位。
　　6. RNF2和MANF在HCC病人的肝臟組織中共定位
　　肝細胞癌病人的肝臟組織經(jīng)包埋切片之后，用免疫熒光雙標方法檢測RNF2和MANF在組織中的表達情況。結果表明兩者在肝癌組織中也存在共定位現(xiàn)象。
　　7. RNF2和MANF在肝組織中的相互作用
　　為觀察RNF2和MANF在肝癌組織中是否存在相互作用，我們將肝癌組

12、織研磨提取蛋白之后進行免疫共沉淀實驗。用RNF2抗體沉淀組織中的RNF2蛋白，用IB檢測免疫沉淀物中是否有MANF；同時用抗MANF的抗體共沉淀RNF2。結果提示，RNF2可以與MANF在肝癌組織中相互作用。
　　8. RNF2不影響MANF基因的轉(zhuǎn)錄
　　在SMMC-7721細胞中沉默RNF2或者轉(zhuǎn)染過表達RNF2的質(zhì)粒，用RT-PCR的方法檢測MANF基因的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)無論是在沉默RNF2還是過表達RNF2的細胞中

13、，與對照組相比MANF的mRNA水平幾乎保持不變。
　　9. RNF2影響MANF的蛋白水平
　　在SMMC-7721細胞中，瞬時轉(zhuǎn)染RNF2-siRNA或RNF2-myc質(zhì)粒，采用免疫印跡方法檢測MANF的蛋白表達水平。結果表明在沉默RNF2之后MANF的表達下調(diào)；而在過表達RNF2之后MANF的表達上調(diào)；用細胞免疫熒光方法檢測MANF的表達水平，發(fā)現(xiàn)在RNF2被沉默的細胞中，MANF的表達也低，而在RNF2被過表達的細胞

14、中，MANF的表達量也上調(diào)。
　　10. RNF2劑量依賴性的調(diào)節(jié)MANF的蛋白水平
　　在SMMC-7721細胞中分別轉(zhuǎn)染RNF2-myc質(zhì)粒0μg、0.25μg、0.5μg、1.0μg，并分為對照組、TM刺激組（6 h）、OGD刺激組（2.5 h），用免疫印跡方法來檢測MANF的蛋白表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，隨著RNF2-myc轉(zhuǎn)染劑量的逐漸增加MANF的蛋白水平也逐漸增加。提示MANF在蛋白水平上對RNF2存在劑量依賴性。<