水泡口炎病毒（VSV）基質蛋白（M）抗腫瘤作用研究.pdf

1、水泡口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)是彈狀病毒科的原型病毒，為有包膜的負鏈RNA病毒。由于它可以在腫瘤細胞中選擇性復制而被用于腫瘤治療，在多種腫瘤模型中都表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用，因此VSV是一種較有前途的溶瘤病毒。但可復制的溶瘤病毒應用于腫瘤臨床治療始終存在著安全隱患，因此有必要探尋更為安全的利用病毒治療腫瘤的方法。文獻報道，在VSV病毒編碼的五種蛋白中基質(Matrixprotein，M)蛋白在

2、VSV誘導的細胞病變中起著重要的作用，如：引起細胞變圓和細胞凋亡，而且在沒有VSV其他蛋白成分存在的情況下M蛋白仍然可以引起細胞這些特征性病變?；贛蛋白的這一重要功能，同時為了避免復制完全型病毒在臨床治療中可能面臨的諸多問題，我們設想將VSV病毒的功能基因-M蛋白基因用于腫瘤的基因治療研究中，通過其誘導腫瘤細胞凋亡，從而達到抗腫瘤效應。同時M蛋白基因導入機體后表達的M蛋白又可以激發(fā)機體的抗腫瘤免疫反應，從而使M蛋白的抗腫瘤作用增強。

3、 為了探討這一假設，我們構建了含有VSV M蛋白基因的真核表達質粒pcDNA3.1(+)-M，簡稱為(p-m)，經(jīng)酶切、RT-PCR測序鑒定M基因插入正確，體外轉染COS-7細胞后48～72小時收獲細胞，RT-PCR、western blot檢測到M蛋白的體外表達。在體外的細胞學實驗中，用脂質體轉染方法轉染人肺腺癌A549、小鼠Lewis肺癌LL／2c、人結腸腺癌SW480、小鼠結腸腺癌CT26，倒置顯微鏡下可以觀察到明顯的細胞

4、形態(tài)學改變，MTT檢測與對照各組包括空載體轉染組、脂質體單純處理組和不處理組相比，M蛋白轉染組可以觀察到細胞生長明顯抑制。轉染細胞后48小時PI染色的熒光顯微鏡觀察到典型的細胞凋亡時相核改變，流式細胞術檢測到亞G1期細胞明顯增高，也提示腫瘤細胞凋亡。接下來的動物實驗研究中我們進行了成瘤性實驗和治療性實驗。成瘤性實驗采用MethA纖維肉瘤模型，實驗動物分3組，腫瘤細胞分別轉染pcDNA3.1-M(M組)、pcDNA3.1空載(P組)及不處

5、理的對照(N組)，轉染后6小時用1×10<'6>細胞皮下接種BALB／c小鼠，結果20天后M組未觀察到腫瘤形成，而N組和P組腫瘤平均達到了1000mm<'3>。在LL／2c、CT26及MethA治療模型中，我們觀察到已建立的腫瘤生長明顯抑制，腫瘤生長緩慢甚至停止，在MethA模型中腫瘤明顯消退，荷瘤小鼠生存期明顯延長。Cr<'51>釋放試驗觀察到來源于脂質體M蛋白質粒復合物治療組的脾細胞產(chǎn)生了明顯的腫瘤細胞特異性的CTL活性，且這種殺傷

6、活性能夠被抗CD8<'+>和MHC-I類單抗阻斷，但不能被抗CD4<'+>和MHC-II單抗阻斷。淋巴細胞過繼實驗也證實抗腫瘤免疫反應主要依賴于CD8<'+>T淋巴細胞。HE染色可以看到M蛋白治療組中有大片腫瘤組織壞死，TUNEL染色檢測到大量的腫瘤細胞凋亡。 我們的研究首次將VSV的基質蛋白基因-M基因用于腫瘤基因治療，觀察到明顯的腫瘤細胞凋亡，腫瘤生長抑制，延長了荷瘤小鼠的生存時間，同時激發(fā)了機體的抗腫瘤免疫反應。因此我們