腺病毒介導的小鼠內(nèi)皮抑素對荷骨肉瘤裸鼠肺轉移抑制的研究.pdf

1、目的:通過自行構建腺病毒介導的小鼠內(nèi)皮抑素并觀察其在體內(nèi)、外的表達及對腫瘤血管和荷骨肉瘤裸鼠肺轉移的抑制作用,探討內(nèi)皮抑素表達水平與骨肉瘤肺轉移的關系。
　　 方法:1、以mEndostatin質(zhì)粒為模板通過PCR方法擴增回收mEndostatin基因,將mEndostatin基因連接到腺病毒載體PDC315中,構建PDC315-mEndo表達質(zhì)粒。將此表達質(zhì)粒與腺病毒重組質(zhì)粒pBGHE3通過lipofecetamine2000

2、共同轉染293細胞,經(jīng)同源重組產(chǎn)生重組腺病毒Ad-mEndo,用氯化銫密度梯度超速離心法純化,用50％組織培養(yǎng)感染劑量法測定病毒滴度。體外轉染骨肉瘤細胞株MG-63,用western印跡檢測感染的骨肉瘤細胞上清液mEndostatin的表達并通過雞胚絨毛尿囊膜實驗(CAM)觀察其抑制血管形成的活性。2、建立荷骨肉瘤裸鼠動物模型:采用骨肉瘤細胞系MG-63,0.2ml細胞懸液(約1x106個細胞)/只注射到30只裸鼠右前肢皮下,一周后全部

3、成瘤,隨機分為3組:Ad-mEndo組(10只),Ad-EGFP組(10只),PBS組(10只)。另外以未接種腫瘤細胞的裸鼠(10只)作空白對照組。然后各組每周分別注射相應藥物200ul/次,連續(xù)五次,最后抽血用免疫酶聯(lián)吸附反應(ELISA)檢測其內(nèi)皮抑素表達水平;并用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑計算腫瘤體積,并于七周后處死觀察有無肺轉移。
　　 結果：1、擴增得到的mEndostatin經(jīng)酶切鑒定、PCR擴增、DNA測序證實為

4、鼠源性內(nèi)皮抑素,重組腺病毒Ad-mEndo的滴度為2.5×1010pfu/ml,體外能高效轉染骨肉瘤細胞株,可分泌表達有抑制血管形成活性的mEndostatin。2、治療結束后Ad-mEndo組腫瘤體積明顯小于Ad-EGFP組和PBS組而其內(nèi)皮抑素表達水平明顯高于Ad-EGFP組和PBS組,并有顯著性差異(P＜0.05)。同時觀察三組裸鼠的肺臟發(fā)現(xiàn)Ad-mEndo組肺部未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉移灶,而其他兩組裸鼠肺部可見大量散在轉移灶,肺轉移率＞7