高效靶向調(diào)控Fas基因表達(dá)治療人卵巢癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、Fas基因是調(diào)控細(xì)胞凋亡最重要的基因，F(xiàn)as/Fas配體(FasL)通路異常不但與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，而且可能與腫瘤細(xì)胞對(duì)部分化療藥物的敏感性有關(guān)。部分卵巢癌細(xì)胞中Fas基因表達(dá)水平低下或缺失，一方面使腫瘤細(xì)胞對(duì)Fas基因介導(dǎo)凋亡的敏感性下降，另一方面也可能導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生抵抗。提高腫瘤細(xì)胞中Fas基因表達(dá)水平可能是卵巢癌基因治療的一種有效方法，但外源基因不能在靶部位獲得高效表達(dá)是目前腫瘤基因治療面臨的突出問題，本研究著重探討

2、如何實(shí)現(xiàn)Fas基因在腫瘤部位獲得高效特異性表達(dá)及Fas基因表達(dá)后引起的生物學(xué)效應(yīng)。 在研究的第一部分，采用免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)多種卵巢癌細(xì)胞系中Fas基因的表達(dá)，并測(cè)定攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因的腺病毒載體Ad5-EGFP和嵌合型腺病毒載體Ad5F35-EGFP對(duì)不同卵巢癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染率。結(jié)果表明，卵巢癌細(xì)胞中Fas基因表達(dá)具有異質(zhì)性，其中泰素敏感型和耐藥型SKOV3細(xì)胞系Fas表達(dá)水平最低；Ad5和Ad5F3

3、5對(duì)不同卵巢癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率差異較大，但就對(duì)同一種卵巢癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染能力而言，Ad5略優(yōu)于Ad5F35。 第二部分應(yīng)用基因重組技術(shù)克隆構(gòu)建了3個(gè)含腫瘤特異性啟動(dòng)子hTERT及二步轉(zhuǎn)錄放大系統(tǒng)(TSTA)調(diào)控元件的穿梭質(zhì)粒，分別命名為pDC316-hTERT-Fas、pDC316-hTERT-GAL4VP2、pDC316-G5E4T-Fas，采用AdMaxTM系統(tǒng)將其包裝成重組腺病毒載體Ad5-hTERT-Fas、Ad5-hTE

4、RT-GAL4VP2和Ad5-G5E4T-Fas，并進(jìn)行純化擴(kuò)增。 第三部分采用制備好的重組腺病毒分別轉(zhuǎn)染泰素敏感型/耐藥型SKOV3細(xì)胞系及人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)，并測(cè)定Fas基因表達(dá)水平；然后分別聯(lián)合應(yīng)用抗FasIgM抗體或γδT淋巴細(xì)胞，觀察癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及化療敏感性有無(wú)改變。結(jié)果證實(shí)，攜帶hTERT和TSTA調(diào)控元件的Ad5轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后，能使靶基因在卵巢癌細(xì)胞中特異性表達(dá)，熒光定量PCR表明Ad5轉(zhuǎn)染的SKO

5、V3細(xì)胞中Fas基因表達(dá)量提高14倍?？笷asIgM抗體能使轉(zhuǎn)導(dǎo)Fas的SKOV3凋亡率明顯提高，γδT細(xì)胞對(duì)其殺傷率亦明顯增強(qiáng)。但Fas基因轉(zhuǎn)導(dǎo)前后，耐藥型SKOV3細(xì)胞系對(duì)泰素的敏感性無(wú)明顯改變。 第四部分建立人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，通過(guò)比較向瘤體內(nèi)注射不同藥物后腫瘤的生長(zhǎng)狀況，以評(píng)價(jià)攜帶Fas基因的腺病毒聯(lián)合γδT細(xì)胞治療人卵巢癌皮下移植瘤的可行性。結(jié)果顯示，攜帶EGFP報(bào)告基因或Fas基因的腺病毒瘤體直接注射后，外源

6、基因在靶部位出現(xiàn)較強(qiáng)表達(dá)，Ad5-hTERT-TSTA-Fas聯(lián)合γδT細(xì)胞治療皮下移植瘤有相當(dāng)?shù)男Ч?，重量抑瘤率達(dá)50.9％。 結(jié)論：就卵巢癌細(xì)胞和非永生化細(xì)胞而言，hTERT啟動(dòng)子能調(diào)控外源基因在卵巢癌細(xì)胞中特異性表達(dá)，TSTA系統(tǒng)能明顯增強(qiáng)弱啟動(dòng)子hTERT的活性，使靶基因在卵巢癌細(xì)胞中高效特異性表達(dá)?？笷asIgM抗體或γδT細(xì)胞能對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)Fas基因的SKOV3細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡及造成明顯生長(zhǎng)抑制；攜帶Fas基因的腺病毒聯(lián)合γδ