TFEB介導(dǎo)的自噬在胃癌耐藥中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　據(jù)2012年GlOBOCAN全球腫瘤統(tǒng)計(jì)，全球每年42.5％新發(fā)胃癌病例來自我國。45.0%胃癌病死人數(shù)來自我國。因此，胃癌對人類健康，尤其是國人健康存在極大的威脅。大多數(shù)胃癌患者對胃癌了解不足，缺少定期胃鏡檢查，在確診時(shí)已處于中晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，化療成為防止胃癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的主要治療措施之一。然而，耐藥現(xiàn)象（Drug resistance）常常導(dǎo)致胃癌患者有藥無用，甚至無藥可用，最終導(dǎo)致化療失敗，預(yù)后極差。國內(nèi)外研究

2、同行及我們的多項(xiàng)研究已經(jīng)初步闡明了胃癌耐藥的多種相關(guān)機(jī)制，然而胃癌耐藥產(chǎn)生機(jī)制十分復(fù)雜，其根本機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。因此，從新的角度闡明胃癌耐藥的機(jī)制可為胃癌耐藥研究提供新的思路。自噬（Autophagy）是細(xì)胞通過消化自身，清除胞內(nèi)受損蛋白和細(xì)胞器的重要機(jī)制，與腫瘤發(fā)生發(fā)展具有不可分割的聯(lián)系。有部分研究認(rèn)為自噬能夠通過自噬性死亡抑制腫瘤發(fā)生，然而越來越多的研究提示自噬能夠被腫瘤細(xì)胞利用，成為腫瘤在各種惡劣情況下存活的重要方式。那么，化

3、療藥物能否誘導(dǎo)自噬發(fā)生，化療藥物作用情況下，自噬能否促進(jìn)胃癌細(xì)胞的存活，什么關(guān)鍵分子或者通路在其中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用？其調(diào)控機(jī)制如何？既往研究發(fā)現(xiàn) mTOR是自噬調(diào)控的關(guān)鍵通路，尤其是mTORC1下游的轉(zhuǎn)錄因子TFEB是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控自噬的關(guān)鍵分子，其調(diào)控的細(xì)胞自噬在脂質(zhì)代謝紊亂、帕金森等多種代謝蓄積性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。然而，TFEB在腫瘤中所扮演的角色尚不明確。那么，TFEB是否參與胃癌惡性表型，尤其是胃癌耐藥？TFEB是否通過調(diào)

4、控胃癌細(xì)胞自噬促進(jìn)胃癌耐藥？其機(jī)制如何？目前尚不明確。
　　目的：
　　1、明確在化療情況下，自噬水平的變化情況及其對胃癌細(xì)胞存活的作用；
　　2、探討化療情況下，自噬關(guān)鍵分子信號(hào)通路mTORC1/TFEB的變化情況；
　　3、闡明自噬關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子TFEB在胃癌耐藥中的關(guān)鍵作用及其調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1、利用western blot、MDC染色、RFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染、電鏡等方法

5、在體外檢測化療情況下胃癌細(xì)胞自噬水平的變化；
　　2、利用免疫組化檢測LC3，觀察化療藥物對裸鼠成瘤瘤體的自噬水平的影響；
　　3、利用 MTT藥敏實(shí)驗(yàn)、凋亡檢測等方法在體外驗(yàn)證化療情況下自噬對胃癌細(xì)胞存活的作用；
　　4、利用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)驗(yàn)證化療情況下自噬對胃癌細(xì)胞存活的作用；
　　5、利用western blot、免疫熒光方法觀察自噬關(guān)鍵通路mTORC1/TFEB信號(hào)通路的變化；
　　6、利用免疫

6、組化觀察轉(zhuǎn)錄因子TFEB在胃癌中的表達(dá)情況和亞細(xì)胞分布；
　　7、運(yùn)用 MTT藥敏實(shí)驗(yàn)、凋亡、高內(nèi)涵分析等相關(guān)分子生物學(xué)檢測技術(shù)，研究TFEB通過調(diào)控其下游靶基因Lamp1等分子，促進(jìn)胃癌細(xì)胞在化療情況下存活的關(guān)鍵作用及調(diào)控機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、自噬是胃癌細(xì)胞在化療藥物作用情況下的一種重要存活機(jī)制
　?。?）化療藥物EPI和CIS能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生自噬
　　化療藥物表柔霉素（EPI）和順鉑（CIS）

7、能夠誘導(dǎo)LC3II表達(dá)增高，并促進(jìn)p62的降解；而具有溶酶體抑制作用的抗瘧疾藥物氯喹（CQ）、液泡型ATP酶抑制劑BAF能夠抑制EPI誘導(dǎo)的自噬流。MDC染色結(jié)果顯示EPI能夠使酸性囊泡增加； RFP-GFP-LC3腺病毒感染后，免疫熒光結(jié)果顯示 EPI能夠自噬體（RFP+GFP+）明顯增加，溶酶體抑制劑CQ能夠促進(jìn)EPI誘導(dǎo)的自噬體增加；電鏡顯示EPI能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞內(nèi)雙層膜結(jié)構(gòu)的生成；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明，腹腔注射EPI能夠使裸鼠荷瘤的瘤

8、體LC3表達(dá)增高。
　　（2）抑制自噬能夠提高胃癌細(xì)胞對化療藥物EPI和CIS的敏感性
　　MTT結(jié)果顯示，利用溶酶體抑制劑CQ抑制胃癌細(xì)胞的自噬作用，能夠增加胃癌細(xì)胞對EPI和CIS的敏感性；凋亡實(shí)驗(yàn)顯示聯(lián)用CQ+EPI能夠顯著增加EPI誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明CQ+EPI聯(lián)用能夠明顯降低裸鼠荷瘤瘤體的體積和重量。
　　2、mTORC1/TFEB調(diào)控通路是化療藥物誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路
　?。?）化

9、療藥物能夠抑制mTORC1
　　EPI和CIS能夠以時(shí)間依賴的方式抑制mTOR分子Ser2448位點(diǎn)的磷酸化；與此一致，mTORC1下游的p70S6K分子Thr389位點(diǎn)的磷酸化也明顯受到抑制；
　?。?）化療藥物能夠誘導(dǎo)mTORC1下游轉(zhuǎn)錄因子TFEB入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用
　　Western blot顯示EPI能夠以時(shí)間依賴的方式促進(jìn)TFEB的去磷酸化；免疫熒光顯示EPI能夠誘導(dǎo)TFEB發(fā)生核轉(zhuǎn)位；通過分離核漿蛋白，我們

10、發(fā)現(xiàn)隨著EPI處理時(shí)間的延長，胞漿定位的TFEB表達(dá)逐漸降低，而胞核定位的TFEB表達(dá)逐漸增加；免疫共沉淀顯示mTOR、Raptor、YWHA在正常情況下能夠與TFEB結(jié)合，而EPI作用下與TFEB的結(jié)合能力逐漸減弱。
　?。?）免疫組化結(jié)果顯示胃癌組織中 TFEB表達(dá)明顯比癌旁組織增高，且主要表達(dá)于胃癌細(xì)胞的胞核中，并與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)；
　　3、TFEB通過調(diào)控自噬和Lamp1介導(dǎo)的溶酶體功能，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的存活

11、>　?。?）過表達(dá)TFEB能夠自噬發(fā)生和溶酶體生成，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的存活
　　MTT結(jié)果和凋亡實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá) TFEB及其 S11A突變體能夠降低化療藥物EPI誘導(dǎo)的凋亡，促進(jìn)胃癌細(xì)胞存活。TFEB能夠促進(jìn)自噬，并轉(zhuǎn)錄激活Lamp1等溶酶體相關(guān)分子表達(dá)。
　?。?）干擾TFEB表達(dá)能夠抑制化療藥物誘導(dǎo)的自噬，提高化療敏感性
　　抑制TFEB在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)能夠胃癌細(xì)胞的化療敏感性；抑制TFEB表達(dá)能夠明顯抑制EPI介導(dǎo)

12、的LC3 II增高和p62降解；同時(shí)明顯抑制EPI介導(dǎo)的細(xì)胞中的平均 Lysotracker數(shù)目增加；在胃癌阿霉素耐藥細(xì)胞7901/ADR中抑制TFEB的表達(dá)能夠顯著提高其藥物敏感性；
　?。?）TFEB通過調(diào)控Lamp1介導(dǎo)的溶酶體功能，促進(jìn)胃癌細(xì)胞對化療的抵抗
　　MTT結(jié)果和凋亡實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制Lamp1能夠顯著增加胃癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。Western blot和免疫熒光結(jié)果抑制 Lamp1能夠反饋性促進(jìn) EPI誘導(dǎo)

13、的TFEB核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)自噬對化療情況下胃癌細(xì)胞的存活具有重要保護(hù)作用，抑制自噬能夠增加胃癌的化療效果；mTORC1/TFEB通路是調(diào)控自噬的重要通路，是化療藥物相關(guān)自噬的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑。TFEB作為mTOR下游的重要的自噬轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)因子，在胃癌組織中表達(dá)明顯升高，且主要表達(dá)于胞核，其表達(dá)水平與胃癌預(yù)后密切相關(guān)；化療藥物EPI和CIS等通過抑制mTORC1，促進(jìn)TFEB發(fā)生去磷酸化，去磷酸化的TFE