自噬在膽汁淤積誘導肝損傷中的作用及其機制研究.pdf

1、膽汁淤積是膽汁生成或流動障礙所致的一組疾病的共同臨床癥狀，它是膽管系統(tǒng)的結石、炎癥、腫瘤等眾多肝膽系統(tǒng)疾病的重要臨床表現之一。此外近年來由于腹腔鏡技術的普及，醫(yī)源性膽道損傷導致的膽汁淤積也有上升的趨勢。膽汁淤積造成肝損傷的過程中，膽鹽毒性作用一直是大家關注的焦點。甘氨鵝脫氧膽酸(GCDC)是膽汁成分中的重要膽鹽之一,具有較強的損傷作用，持續(xù)高濃度的毒性膽鹽在血液和肝中持續(xù)滯留被認為是導致肝損傷的主要原因。毒性膽鹽刺激可使肝細胞損傷、膽管

2、增殖、肝纖維化;如果未能及時糾正，可逐漸進展為膽汁淤積性肝硬化，最終導致肝功能衰竭。盡管近年來其分子機制研究取得了一些進展，但膽汁淤積引起肝細胞損傷的具體機制仍未完全闡明，對許多無法手術的患者，仍缺乏有效的治療手段。因此，從分子水平進一步深入探討膽汁淤積引起肝細胞損傷的機制，可能為藥物治療提供新的思路。
　　 自噬是細胞通過降解其自身的細胞質（器）來為生物合成提供可循環(huán)利用的原料，借此維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定和蛋白代謝平衡的過程。當細

3、胞處于不利環(huán)境時，它是一種重要的自我保護機制，對維持細胞存活、避免凋亡有積極的作用。目前自噬在膽汁淤積誘導肝損傷過程中的作用仍不清楚。本課題擬從三個方面對此進行研究:1、通過體內動物膽管結扎模型和體外細胞實驗兩個方面觀察膽汁淤積對肝細胞的損害作用;2、探討自噬在膽汁淤積性肝損傷中的作用;3、進一步研究具體的分子機制，探討ROS在膽汁淤積誘導肝損傷過程中的作用及其與自噬的關系。
　　 第一部分膽汁淤積性肝損傷模型的建立
　　

4、 首先在體外建立甘氨鵝脫氧膽酸(GCDC)誘導的肝細胞損傷模型。應用不同劑量的GCDC處理正常肝細胞系L02不同時間，觀察不同劑量的GCDC對L02肝細胞存活的影響以及藥物和劑量、時間之間的依賴關系。結果證實:甘氨鵝脫氧膽酸(GCDC)能夠在體外誘導肝細胞死亡，且隨其濃度增加，肝細胞生長抑制率亦明顯上升;其次通過對小鼠進行膽管結扎(BDL)，模擬體內病生理過程，建立小鼠膽汁淤積模型。通過檢測小鼠體內血清膽紅素、ALT、AST等各項指標

5、，觀察膽汁淤積模型是否構建成功。結果提示，雙重結扎小鼠膽管后血清膽紅素及ALT、AST等各項指標隨著時間的延長均有顯著升高，提示膽汁淤積模型建立成功。
　　 第二部分自噬在膽汁淤積誘導肝損傷中的作用
　　 以GCDC(200μM)處理L02細胞，通過熒光顯微鏡觀察轉染了GFP-LC3質粒的細胞中GFP-LC3點的聚集，并以透射電鏡觀察自噬小體的聚集情況;通過WesternBlotting在蛋白水平檢測LC3的表達，從多方

6、面檢測GCDC是否影響肝細胞自噬的發(fā)生。同時為了進一步明確自噬是否影響膽汁淤積造成的肝細胞損傷，使用自噬抑制劑氯喹(CQ)或自噬誘導劑雷帕霉素(Rapamycin)作用于肝細胞，應用流式細胞儀檢測自噬被抑制或促進前后細胞凋亡的變化，從而探討自噬在膽汁淤積誘導肝損傷中的作用。體內實驗方面，使用CQ或Rapamycin作用于BDL模型小鼠，TUNEL檢測抑制或誘導自噬后小鼠肝細胞凋亡的變化;對肝組織進行病理分析，比較各實驗組肝細胞壞死程度。

7、結果顯示:GCDC處理L02細胞后可在熒光顯微鏡下觀察到大量點狀綠色熒光分布，說明GCDC可以誘導自噬的發(fā)生，電鏡檢測和Western Blotting進一步證實了該結果;隨后通過流式細胞術檢測發(fā)現，CQ抑制自噬后肝細胞凋亡增加，Rapamycin促進自噬后細胞凋亡減少，而壞死無明顯變化，提示自噬可能通過抑制GCDC誘導的肝細胞凋亡保護肝細胞。另外在BDL小鼠中，CQ抑制自噬后TUNEL顯示肝細胞凋亡明顯增加，HE顯示肝組織的損傷明顯加

8、重;Rapamycin組結果則相反，也提示在體內自噬可能是通過抑制細胞凋亡，從而促進BDL模型中肝細胞的生存。
　　 第三部分自噬通過清除ROS保護膽汁淤積誘導的肝損傷
　　 為探討ROS在膽汁淤積誘導肝損傷中的作用及其與自噬的關系，實驗分為三個步驟。首先檢測GCDC作用下ROS的活性，發(fā)現GCDC能夠誘導ROS的產生，而抗氧化劑NAC能夠抑制ROS的累積。隨后為了探討ROS和自噬之間的關系，使用WesternBlott

9、ing檢測GCDC誘導自噬過程中，NAC作用前后LC3的變化。結果顯示，NAC能使GCDC誘導的LC3表達部分下調，說明ROS含量的變化與自噬的發(fā)生相關。
　　 動物體內實驗中選用細胞DNA氧化損傷的標志8-OHdG作為間接檢測ROS含量的指標，結果顯示BDL組中8-OhdG含量低于CQ+BDL組，而Rapamycin組結果相反，也說明抑制自噬后ROS含量增多，提示ROS可能參與了BDL誘導的自噬。最后，我們研究了自噬對GCDC

10、誘導肝損傷的保護過程中ROS的作用。結果提示CQ抑制自噬后ROS的含量增多，MTT檢測證實NAC作用后CQ組細胞生存率明顯上升，提示GCDC誘導的自噬可能通過降低ROS的含量從而保護細胞存活。綜上，我們的研究結果提示:
　　 1.膽汁淤積能夠誘導肝細胞發(fā)生自噬，自噬能夠促進受損肝細胞的存活，減少肝細胞的凋亡;自噬被抑制后其對肝細胞的保護作用明顯降低。
　　 2.ROS參與了GCDC誘導的肝細胞損傷，自噬可能通過降低ROS