APP-PS1轉(zhuǎn)基因小鼠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)及頭孢曲松的干預(yù)研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，也是老年人癡呆中最常見(jiàn)的類型，其中占癡呆患者總數(shù)的60％以上。臨床表現(xiàn)有記憶障礙、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等。AD主要有3種不同的神經(jīng)病理表現(xiàn):細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)、細(xì)胞外的老年斑和神經(jīng)元的丟失。
　　神經(jīng)纖維纏結(jié)是由于細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau的聚集。過(guò)度磷酸化的tau蛋白促進(jìn)微管蛋白聚集和組裝能力降低，導(dǎo)致微管穩(wěn)定性下降。tau蛋

2、白磷酸化受蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶調(diào)節(jié)，皮層神經(jīng)纖維纏結(jié)的分布和數(shù)目與認(rèn)知障礙呈正相關(guān)，是疾病進(jìn)展的標(biāo)志。細(xì)胞外的老年斑是由β-淀粉樣蛋白(amyloidβ，amyloidβ)聚集形成的。細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白斑塊見(jiàn)于AD患者腦內(nèi)的大部分區(qū)域，并與嗅皮層、海馬及相關(guān)皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元的丟失有關(guān)。在腦內(nèi)斑塊的數(shù)量與癡呆嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)，腦內(nèi)Aβ的總量水平與認(rèn)知減退有關(guān)。Aβ增加了tau磷酸化，并且啟動(dòng)多個(gè)途徑導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡。AD腦內(nèi)神經(jīng)元和突觸變性多

3、發(fā)生在高密度的淀粉樣斑和纖維纏結(jié)區(qū)域。受累嚴(yán)重的區(qū)域包括海馬、嗅皮質(zhì)、杏仁核、新皮層和皮層下區(qū)域，海馬和額顳頂葉的谷氨酸能神經(jīng)元受累較重，而在運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)皮層的類似神經(jīng)元相對(duì)保留。因?yàn)楹ｑR和皮層與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)，很可能谷氨酸能神經(jīng)元的變性是AD發(fā)病中的早期事件。近來(lái)的研究顯示谷氨酸能突觸前密度降低與認(rèn)知障礙的相關(guān)性要超過(guò)纖維纏結(jié)和Aβ負(fù)荷。AD動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn)膽堿能突觸前小結(jié)的上調(diào)發(fā)生在谷氨酸能突觸末端受累之前，很可能膽堿能系統(tǒng)影響了腦內(nèi)

4、谷氨酸能神經(jīng)元的功能和生存。以谷氨酸作為主要神經(jīng)遞質(zhì)皮層的椎體神經(jīng)元具有膽堿能和谷氨酸能兩種受體，并接收來(lái)自基底前腦膽堿能神經(jīng)元的信息輸入。AD患者尸檢額葉皮層內(nèi)，突觸后毒蕈堿M1和G-蛋白的解偶聯(lián)與NMDA受體密度和蛋白激酶C的活性下降有關(guān)。這些研究都提示膽堿能系統(tǒng)和谷氨酸能系統(tǒng)互相作用，并可能激發(fā)了AD的病理異常。這也說(shuō)明，谷氨酸能系統(tǒng)與AD中的Aβ和tau蛋白之間存在某些聯(lián)系并互相作用。
　　谷氨酸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的突觸傳遞

5、、神經(jīng)元生長(zhǎng)和分化、突觸可塑性、學(xué)習(xí)和記憶等方面都發(fā)揮重要作用，也是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。谷氨酸能神經(jīng)元在神經(jīng)系統(tǒng)均有分布，但他們主要分布在大腦皮層和腦的邊緣系統(tǒng)。谷氨酸能系統(tǒng)通過(guò)控制突觸內(nèi)的谷氨酸的濃度將神經(jīng)沖動(dòng)轉(zhuǎn)化為化學(xué)刺激。在突觸前神經(jīng)元，囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體VGLUT1和VGLUT2將谷氨酸儲(chǔ)存于囊泡中。
　　β-內(nèi)酰胺酶類藥物作為臨床使用的重要抗生素之一。Rothstein等于2005年篩選了FDA批準(zhǔn)

6、的藥品，以在其中尋找到能夠提高神經(jīng)保護(hù)蛋白GLT1體外表達(dá)的藥物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶類以濃度依賴的方式能夠提高GLT1蛋白的表達(dá)。GLT1能夠通過(guò)將神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸從突觸間隙中移除，從而抑制興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用。在轉(zhuǎn)基因小鼠中，增加谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，GLT1可實(shí)現(xiàn)在正常和異常神經(jīng)傳遞中的整合作用。β-內(nèi)酰胺酶類誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-κ3的活化，活化的NF-κ3連接于GLT1啟動(dòng)子區(qū)域，從而上調(diào)GLT1基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低突觸間隙內(nèi)谷

7、氨酸的濃度并弱化谷氨酸過(guò)多產(chǎn)生的神經(jīng)毒性。治療肌萎縮側(cè)索硬化的唯一藥物利魯唑(riluzole)同樣是GLT1表達(dá)的激動(dòng)劑，該藥物在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了GLT1—谷氨酸—神經(jīng)變性這一演進(jìn)模式。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶類藥物在11種疾病的體內(nèi)或體外試驗(yàn)中能夠增加GLT1的表達(dá)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。在谷氨酸/GLT1相關(guān)神經(jīng)疾病的體內(nèi)試驗(yàn)中，頭孢曲松被證實(shí)是最有效的神經(jīng)保護(hù)劑。頭孢曲松的明顯優(yōu)勢(shì)是能夠穿透血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)。
　　方法：<

8、br>　　3月齡健康雄性APP/PS1小鼠，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，12h晝夜循環(huán)光照，24℃恒溫，60％濕度，自由進(jìn)食水1月。4月齡野生型雄性C57BL/6小鼠作為對(duì)照使用小鼠。體重25～29g。WT+NS組:4月齡野生型雄性C57BL/6小鼠8只，不予以注射任何藥物或試劑;WT+Cef組:4月齡野生型雄性C57BL/6小鼠8只，以腹腔注射頭孢曲松200 mg/kg qd×7天;APP/PS1+NS組:4月齡健康雄性APP

9、/PS1小鼠8只，以腹腔注射0.2ml生理鹽水;APP/PS1+Cef組:4月齡健康雄性APP/PS1小鼠8只，以腹腔注射頭孢曲松200 mg/kg qd×7天。四組之間小鼠體重月齡無(wú)明顯差異。藥物干預(yù)后，繼續(xù)喂養(yǎng)小鼠7天。試驗(yàn)結(jié)束后給予3％苯巴比妥鈉腹腔注射(40 mg/100 g)，小鼠麻醉取腦，留取海馬組織備用。均在大致相同的海馬結(jié)構(gòu)斷面上選取切片。行Cresyl violet染色，光鏡下通過(guò)尼氏染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)

10、和數(shù)目。海馬區(qū)Aβ斑免疫組織化學(xué)染色。Westernblotting檢測(cè)GLAST蛋白和GLT-1蛋白的表達(dá)。RT-PCR法GLAST mRNA和GLT-1mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Cresyl violet染色觀察:野生正常組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)較規(guī)則，排列整齊而致密，層次多，細(xì)胞核大而橢圓形，核仁明顯，細(xì)胞間隙清楚，尼氏體非常豐富。APP/PS1組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列紊亂不規(guī)則，層次

11、減少，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)脫失，細(xì)胞界限不清晰，胞體大小不規(guī)則，存在腫脹和縮小，胞核皺縮深染，核仁不清;部分胞核固縮明顯，可見(jiàn)核碎裂。經(jīng)頭孢曲松干預(yù)后神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)及形態(tài)無(wú)明顯變化。
　　2.海馬區(qū)淀粉樣斑的觀察:APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠Aβ斑的表達(dá)與正常野生小鼠比較明顯增加(P＞0.05)，正常野生小鼠腦內(nèi)各區(qū)域沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Aβ斑的存在。APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠在使用頭孢曲松干預(yù)后Aβ斑的表達(dá)與對(duì)照組比較沒(méi)有顯示明顯降低(P＞0.05)。

12、r>　　3.Western blotting檢測(cè)GLAST蛋白和GLT-1蛋白的表達(dá):APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠GLAST和GLT-1蛋白的表達(dá)與正常野生小鼠比較明顯降低(P＜0.05)。APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠在使用頭孢曲松干預(yù)后GLAST蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較沒(méi)有顯示明顯變化(P＞0.05)，頭孢曲松干預(yù)后的GLT-1蛋白的表達(dá)與經(jīng)生理鹽水干預(yù)的對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.RT-PCR法GLAST mRN

13、A和GLT-1mRNA的表達(dá):APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠GLASTmRNA的表達(dá)與正常野生小鼠比較沒(méi)有顯示明顯降低(P＞0.05)，但APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠GLT-1mRNA的表達(dá)較正常野生小鼠顯示明顯降低(P＜0.05)。APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠在使用頭孢曲松干預(yù)后GLAST mRNA的表達(dá)與對(duì)照組比較沒(méi)有顯示明顯增加(P＞0.05)，頭孢曲松干預(yù)后的GLT-1 mRNA的表達(dá)與經(jīng)生理鹽水干預(yù)的對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)