丹參乙酸鎂對高糖誘導的細胞內(nèi)氧化損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、背景：糖尿病患者高血糖誘導的氧化應激與糖尿病及其包括動脈粥樣硬化等一些并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關。盡管目前有多種抗氧化劑應用于防治糖尿病及其并發(fā)癥，但相當一部分抗氧化藥物不具有調(diào)節(jié)氧化應激和增加機體抗氧化防御系統(tǒng)的作用。在臨床上用于防治多種疾病的中藥丹參的單體丹酚酸B，通常以其鏌鹽丹參乙酸鎂(magnesiumlithospermateB,LAB)的形式存在，具有很強的抗氧化性，研究發(fā)現(xiàn)LAB可以通過多種機制抑制高血糖引起的血管損害，從而

2、減緩高血糖誘發(fā)的動脈粥樣硬化進程。
　　 目的：本實驗以人胚腎細胞（HEK293T）細胞為研究對象，進一步證實LAB對氧化應激下細胞內(nèi)活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)產(chǎn)生的影響；同時以血紅素加氧酶(hemeoxygenase，HO-1)為靶點，觀察LAB對高糖誘導下HO-1表達的調(diào)控，并進一步研究LAB調(diào)控HO-1的分子機制。
　　 方法：
　　 1．ROS檢測：收集處理好的細胞，向細

3、胞內(nèi)加入終濃度為lOμmol/LDCFH-DA探針共孵育30min，DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內(nèi)被ROS氧化生成有熒光的DCF。裝載并洗滌未裝載DCFH-DA探針后，在激發(fā)波長488nm、發(fā)射波長525nm條件下，流式細胞儀檢測各組細胞內(nèi)ROS熒光強度。
　　 2．運用QRT-PCR以及Westernblotting檢測高糖及LAB干預對HEK293T細胞內(nèi)HO-1基因mRNA和蛋白表達的影響。

4、r>　　 3．檢測LAB對核轉錄因子E2p45相關因子2(nuclearfactorE2-relatedfactor2，Nrt2)的核移作用。分別用高糖及不同濃度的LAB干預HEK293T細胞，用細胞核蛋白和細胞漿蛋白抽提試劑盒，抽提核內(nèi)總蛋白質(zhì)，運用Westernblotting檢測其對細胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達的影響。
　　 4．采用PCR、轉化、測序等技術構建pRNAT-U6.1/Neo-siNrf2真核表達載體，并將No

5、n-specificcontrolshRNA陰性對照載體、pRNAT-U6.1/Neo-siNrf2真核表達載體分別瞬時轉染入HEK293T細胞，轉染48h后，用高糖及50μmol/LLAB干預HEK293T細胞，Westernblotting檢測細胞內(nèi)Nrf2及HO-1的蛋白表達水平。
　　 結果：
　　 1．與對照組(30.72+-0.47％)相比，30mmol/L高糖組（79.00+-5.8％）以及100μmol/

6、LH2O2組（92.83+-8.9％）細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量明顯增高，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與30mmol/L高糖組（79.00+-5.8％）相比，LAB預處理組(27.41+-4.13％)細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量有回落的趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與100μmol/LH2O2組（92.83+8.9％）相較；LAB干預組(43.66+-5.27％)細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量也有回落的趨勢，差異同樣具有統(tǒng)計學意義(P<0.01

7、)。
　　 2．HEK293T細胞給予高糖刺激后，HO-1mRNA表達上調(diào)，于24h達到高峰，48h有所下降，高糖作用2h，6h，24h，48h和對照組比較，HO-1mRNA相對表達量分別為3.96+-0.71，9.57+-1.39，12.29+-2.54，7.80+-0.40，（P值分別為0.022，0.003，0.000）。蛋白變化趨勢與HO-1mRNA相同，高糖作用第2h,6h，24h和48h，對照組的HO-1與β-act

8、in蛋白表達量的比值分別為0.087+-0.01，0.326+-0.092，0.718+-0.206，0.889+-0.128，0.274+-0.036，其中高糖培養(yǎng)6h和24h明顯增加HO-1蛋白表達(P<0.01)。HEK293T細胞預先30min給予不同濃度的LAB干預后,HO-1mRNA均有不同程度的增加，10μmol/L，50μmol/L，100μmtmol/L劑量的LAB干預組HO-1Mrna相對表達量分別為1.37+-0.

9、32，1.69+-0.31，2.19+-0.26，相較于高糖對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.045，P<0.015，P<0.000)。HO-1蛋白變化趨勢與Mrna相同，高糖對照組與10μmol/L，50μmol/L，100μmol/L劑量的LAB干預組HO-1與β-actin蛋白表達量的比值分別為0.853+-0.107，0.977+-0.061，1.156+-0.0182，1.470+-0.138。10μmol/L丹參乙酸鎂干預

10、組HO-1蛋白水平與高糖組比較沒有顯著性差異，在50μmol/L和100μmol/L時，LAB干預組較高糖對照組顯著增加(P值分別為0.021,0.001)。
　　 3．HEK293T細胞給予高糖刺激24h后，轉錄因子Nrf2轉位于細胞核內(nèi)量增加(P<0.05)，相對于高糖對照組,50μtmol/L，100μmol/LLAB干預組轉位細胞核內(nèi)Nrf2量進一步增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.015，P=0.000)。