高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激對(duì)MnSOD的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的:研究高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cell,MC)內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)與錳超氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase,MnSOD)表達(dá)的關(guān)系及其可能的分子機(jī)制。
　　 方法:本實(shí)驗(yàn)主要通過體外高糖培養(yǎng)大鼠MC進(jìn)行研究。設(shè)立正常組(NS組)、甘露醇組(MA組)、高糖組(HG組)、溶媒對(duì)照組(DMSO組)、過氧化氫組(H2O2組)、TGF-β1抑制劑組(SB431542組)、過氧化氫與TGF-β1

2、抑制劑共培養(yǎng)組(HS組)、抗氧化劑組(NAC組)、PI3K抑制劑組(LY-294,002組)。按需要,分別在培養(yǎng)16 h時(shí)檢測(cè)以下各項(xiàng)指標(biāo):流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中ROS的水平(HG組檢測(cè)4h、10h、16h、28h4個(gè)時(shí)間點(diǎn));RT-PCR法測(cè)定TGF-β1 mRNA、MnSOD mRNA的相對(duì)含量;Western blot法測(cè)定細(xì)胞中Akt,p-Akt,FoxO3a,p-FoxO3a,MnSOD蛋白表達(dá)水平;可見光分光光度法測(cè)定胞漿T-

3、SOD和MDA抗氧化指標(biāo)的水平。
　　 結(jié)果:所有結(jié)果均顯示,NS組與MA組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);HG組與DMSO組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 1.對(duì)T-SOD及MDA含量的影響
　　 與NS組比較,HG組表現(xiàn)出T-SOD含量減少(P＜0.01),MDA水平提高(P＜0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與DMSO組比較,SB431542組、NAC組、LY-294,002組表現(xiàn)出T-

4、SOD含量增加(P＜0.01),MDA水平下降(P＜0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.ROS的變化
　　 HG組檢測(cè)4 h、10 h、16 h、28 h4個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)ROS的釋放量,其他各組均只檢測(cè)16 h時(shí)的結(jié)果。HG組與NS組比較,在4h、10 h、16 h、28 h4個(gè)時(shí)間點(diǎn)HG組ROS釋放量均增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),且隨時(shí)間的延長,ROS的生成量有增加的趨勢(shì);與DMSO組相比較,SB4315

5、42組、LY-294,002組及NAC組ROS的生成量均減少,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3.TGF-β1 mRNA水平的變化
　　 PCR結(jié)果顯示,與NS組比較,HG組、H2O2組TGF-β1 mRNA水平有所提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與DMSO組比較,SB431542組、NAC組TGF-β1 mRNA水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與H2O2組比較,HS組TGF-β1 mRN

6、A水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.Akt蛋白磷酸化水平的變化
　　 Western blot結(jié)果顯示,各組間總Akt蛋白表達(dá)無明顯變化(P＞0.05);與NS組比較,HG組、H2O2組P-Akt/T-Akt值升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01);與DMSO組比較,SB-431542組、NAC組p-Akt/T-Akt值降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);HS組結(jié)果與H2O2組比較

7、,p-Akt/T-Akt值降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 5.FoxO3a蛋白磷酸化水平的變化
　　 Western blot結(jié)果顯示,各組間總FoxO3a蛋白表達(dá)無明顯變化(P＞0.05);與NS組比較,HG組、H2O2組P-FoxO3a/T-FoxO3a值升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與DMSO組比較,SB431542組、NAC組、LY-294,002組P-FoxO3a/T-FoxO3a值均

8、降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);HS組結(jié)果與H2O2組比較,p-FoxO3a/T-FoxO3a值降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 6.MnSOD表達(dá)的差異
　　 與NS組比較,HG組和H2O2組MnSOD mRNA水平及其蛋白表達(dá)均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與DMSO組比較,SB431542組、NAC組、LY-294,002組MnSOD mRNA水平及蛋白表達(dá)均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

9、P＜0.05);與H2O2組比較,HS組MnSOD mRNA水平及蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)下,大鼠MC中ROS大量生成,超量生成的ROS可上調(diào)TGF-β1,并激活其下游PI3K/Akt/FoxO3a信號(hào)通路,最終負(fù)性調(diào)控MnSOD的表達(dá)。
　　 2.高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)下,大鼠MC中MnSOD表達(dá)的減少使細(xì)胞清除ROS的能力降低,從而促使R