高糖對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞的氧化損傷作用及其機制的初步研究.pdf

1、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopamy，DR)是糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。高糖是DR的主要致病因素，控制血糖水平可以影響DR的發(fā)生發(fā)展已是無可爭議的。近年的研究表明，氧化應(yīng)激作為一種病理過程參與了許多嚴(yán)重眼底疾病的發(fā)病機制，高糖等多種致病因素都能通過這一途徑而發(fā)揮致病作用?；钚匝?reactive oxygenspecies，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)自由基損害在氧化應(yīng)

2、激損傷中起重要作用。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigmentepithelium，RPE)細胞是血視網(wǎng)膜屏障的主要組成成分，在維護視網(wǎng)膜正常生理功能方面具有極其重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，高糖可以造成RPE細胞損傷，影響視網(wǎng)膜外屏障功能，但其確切機制尤其是分子機制尚未闡明。p38信號通路(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)是一條應(yīng)激敏感的通路，高糖刺激可以激活p38 MAPK，使其

3、磷酸化表達增加，發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。本研究的目的就在于闡明高糖對RPE細胞生長的影響以及與此相關(guān)的分子機制，尤其關(guān)注高糖對RPE細胞產(chǎn)生ROS和RNS的影響，以及p38 MAPK信號通路在此生物過程中的作用。我們體外培養(yǎng)人RPE細胞，隨機分為四組：正常對照組：用含5.5mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液；高糖組：用含33mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液；高糖+SB203580組：用p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580 10μm

4、mol/L預(yù)處理30min后，加入含33mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液；甘露醇組(滲透壓對照組)：用含5.5mmol/L葡萄糖和27．5mmol/L甘露醇的DMEM培養(yǎng)液。采用倒置顯微鏡觀察細胞生長形態(tài)，MTT法檢測各組細胞生長活力，采用免疫熒光染色和免疫印跡法來研究3-硝基酪氨酸(3-NT)、p-p38和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)蛋白表達的變化，用CM-H<,2>

5、DCFDA熒光染色檢測RPE細胞中ROS的產(chǎn)生量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力。 結(jié)果表明：與正常對照組相比，應(yīng)用含33mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基處理RPE細胞48h可見細胞胞體變薄，形態(tài)表現(xiàn)多樣，不規(guī)則細胞增多；高糖可以抑制RPE細胞增殖，加入特異性p38MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理后，其抑制作用減弱；高糖培養(yǎng)的RPE細胞3-NT、p-p38和iNOS蛋白表達增加，ROS產(chǎn)生明顯增多，超氧化物歧化酶(super

6、oxide dismutase，SOD)活力降低；加入p38MAPK的特異性抑制劑SB203580預(yù)處理后，3-NT、iNOS蛋白表達量較高糖組減少，而ROS產(chǎn)生和SOD活力與高糖組相比沒有明顯變化。 通過以上研究，我們得出下列結(jié)論：(1)高濃度葡萄糖培養(yǎng)可造成人RPE細胞氧化損傷，使細胞形態(tài)和活力發(fā)生變化，并導(dǎo)致細胞中3-NT產(chǎn)生增多。(2)損傷的機制可能為高糖刺激RPE細胞產(chǎn)生大量ROS，同時使細胞抗氧化能力下降，激活RPE