高糖誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞表達(dá)IL-1β及其損傷機(jī)制的研究.pdf

1、[背景]
　　 隨著全球經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,人口老齡化及生活方式現(xiàn)代化等變化,2型糖尿病的患病率正在不斷增加。其致殘率、死亡率僅次于腫瘤和心血管疾病,為第三大非傳染性疾病。2型糖尿病嚴(yán)重威脅人類健康并給社會及家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,糖尿病的防治成為受到廣泛關(guān)注的社會衛(wèi)生問題。
　　 目前普遍認(rèn)為,胰島素抵抗和胰島功能受損是2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。英國前瞻性糖尿病研究顯示,糖尿病患者在被明確診斷時,β細(xì)胞功能只

2、剩下正常人的5096,其后胰島β細(xì)胞功能每年以4％～5％的速度下降。以此推算,在糖尿病診斷前10～15年,β細(xì)胞功能已開始下降。
　　 既往眾多研究認(rèn)為,在2型糖尿病中糖毒性和脂毒性是造成胰島β細(xì)胞功能受損的主要病理機(jī)制。而近年來,研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥損傷在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中同樣發(fā)揮著重要作用。以往認(rèn)為炎癥介質(zhì)是1型糖尿病的發(fā)病關(guān)鍵因素,但不斷有研究顯示炎癥與2型糖尿病之間的同樣存在密切聯(lián)系。有研究報道在2型糖尿病患者

3、的活檢中發(fā)現(xiàn)胰島存在纖維化,而纖維化是慢性炎癥性疾病的最終階段。這是支持胰島局部存在炎癥反應(yīng)的一個有力證據(jù)。此外,還有學(xué)者指出循環(huán)中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子和化學(xué)因子的表達(dá)上調(diào)可作為2型糖尿病發(fā)病的預(yù)測指標(biāo)。由此可見,炎癥因子在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用,已成為糖尿病發(fā)病機(jī)制研究領(lǐng)域中的一個倍受關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　 白介素-1β(IL-1β)是在胰島β細(xì)胞損傷研究中受到廣泛關(guān)注的細(xì)胞因子之一。IL-1β是一種主要由單核一巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞

4、等分泌的細(xì)胞因子,具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。1型糖尿病發(fā)生發(fā)展中,巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β與腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ等構(gòu)成細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡。2002年,Maedler首次發(fā)現(xiàn)將人胰島β細(xì)胞體外培養(yǎng)于高糖中可誘導(dǎo)其分泌細(xì)胞因子IL-1β,利用IL-1β的天然抑制因子白介素1受體拮抗劑(IL-1Ra)能保護(hù)高糖環(huán)境下的胰島β細(xì)胞。提示,高糖環(huán)境下胰島β細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-1β,其分泌的IL-1β可造成

5、胰島β細(xì)胞損傷。體內(nèi)實驗,肥沙鼠以高能量飲食喂養(yǎng)造成2型糖尿病模型,研究發(fā)現(xiàn)血糖升高肥沙鼠的胰島β細(xì)胞可表達(dá)IL-1β,而血糖正常肥沙鼠的胰島β細(xì)胞無IL-1β表達(dá)。隨后其他實驗室還利用另外兩種2型糖尿病動物模型GK大鼠及人胰島淀粉樣多肽轉(zhuǎn)基因大鼠進(jìn)行研究,同樣發(fā)現(xiàn)體內(nèi)高糖環(huán)境可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞合成并分泌IL-1β。但同時也有研究報道,長時間的高糖處理未能引起胰島β細(xì)胞分泌IL-1β。
　　 綜上所述,細(xì)胞因子在2型糖尿病發(fā)病過程

6、中的作用受到了越來越多的重視。而關(guān)于高糖是否誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子IL-1β,這種IL-1β是否損傷胰島β細(xì)胞,目前存在爭議且相關(guān)研究報道尚不多見。因此,本課題將以大鼠胰島細(xì)胞瘤株INS-1細(xì)胞作為研究模型,探討高濃度葡萄糖能否誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞表達(dá)IL-1β及其對胰島β細(xì)胞是否具有損傷作用。在以上研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討高糖環(huán)境下NF-κB抑制劑及羅格列酮對胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用及可能機(jī)制,為保護(hù)胰島β細(xì)胞提供新思路。
　　

7、第一章 高糖誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞表達(dá)IL-1β及其對細(xì)胞損傷作用的研究
　　 [目的]
　　 1、探討高濃度葡萄糖是否誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子IL-1β及不同濃度葡萄糖對INS-1細(xì)胞IL-1β表達(dá)的影響。
　　 2、探討INS-1細(xì)胞表達(dá)的IL-1β對細(xì)胞胰島素分泌功能和凋亡的影響。
　　 [方法]
　　 1、實驗對象
　　 以大鼠胰島β細(xì)胞瘤株INS-1細(xì)胞為研究對象,采用含10％

8、胎牛血清RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時。
　　 2、實驗分組
　　 A:不同濃度葡萄糖對INS-1細(xì)胞IL-1β表達(dá)及細(xì)胞活力的影響
　　 (1):11.1mmol/l葡萄糖組(11.1mM組:葡萄糖濃度為11.1 mM/l);
　　 (2):16.7mmol/l葡萄糖組(16.7mM組:葡萄糖濃度為16.7 mM/l)；
　　 (3):27.8mmo

9、l/l葡萄糖組(27.8mM組:葡萄糖濃度為27.8 mM/l);
　　 (4):33.3mmol/l葡萄糖組(33.3mM組:葡萄糖濃度為33.3 mM/l)；
　　 B:INS-1細(xì)胞表達(dá)的IL-1β對細(xì)胞胰島素分泌功能和凋亡的影響
　　 (1):對照組(Control組:葡萄糖濃度為11.1 mM/1)；
　　 (2):高糖組(HG組:葡萄糖濃度為33.3 mM/l)；
　　 (3):高糖+

10、IL-1Ra干預(yù)組(HG+IL-1Ra組:葡萄糖濃度為33.3mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基+白介素1受體拮抗劑(IL-1Ra 500ng/ml));
　　 3、方法
　　 (1)熒光定量RT-PCR法檢測IL-1βmRNA水平
　　 (2)MTT法檢測INS-1細(xì)胞活力
　　 (3)胰島素放射免疫試劑盒檢測各組胰島素分泌量
　　 (4)Annexin V-PI雙染法檢測各組細(xì)胞凋亡率
　

11、　 4、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。多組間資料比較當(dāng)滿足方差齊性時采用單向方差分析(One-way ANOVA)檢驗,各組均數(shù)多重比較采用LSD法；若不滿足方差齊性時分別采用Welch法和Dunnett’s T3法。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 [結(jié)論]
　　 1、高濃度葡萄糖可誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞表達(dá)IL-1β,這種IL-1β的表

12、達(dá)呈葡萄糖濃度依賴性。
　　 2、高糖誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞表達(dá)的IL-1β可造成β細(xì)胞功能障礙與凋亡。
　　 第二章 高糖誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞表達(dá)的IL-1β造成細(xì)胞損傷可能機(jī)制的研究
　　 [目的]
　　 探討高糖環(huán)境下INS-1細(xì)胞表達(dá)的IL-1β對胰島β細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的可能機(jī)制
　　 [方法]
　　 1、實驗對象
　　 實驗對象及培養(yǎng)方法同第一章。
　　 2、實驗分組<

13、br>　　 (1):對照組(Control組:葡萄糖濃度為11.1mM/1)；
　　 (2):高糖組(HG組:葡萄糖濃度為33.3mM mM/1)；
　　 (3):高糖+IL-1Ra干預(yù)組(HG+IL-1Ra組:葡萄糖濃度為33.3 mM/l的RPMI1640完全培養(yǎng)基+白介素1受體拮抗劑(IL-1Ra 500ng/ml))；
　　 (4):高糖+NF-κB抑制劑干預(yù)組(33.3mM組+NF-κB抑制劑組:NF

14、-κB5umol/l預(yù)孵育一個小時后換葡萄糖濃度為33.3mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基+NF-κB抑制劑5umol/l共培養(yǎng))；
　　 (5):高糖+羅格列酮干預(yù)組(HG+羅格列酮組:葡萄糖濃度為33.3mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基+羅格列酮5umol/l)；
　　 3、方法
　　 (1)免疫細(xì)胞熒光定性分析NF-κB蛋白核轉(zhuǎn)位
　　 (2)免疫印跡法(Western blot)檢測胞核內(nèi)NF-κ

15、B蛋白表達(dá)
　　 (3)熒光定量RT-PCR法檢測IKK βmRNA、IL-1βmRNA水平
　　 (4)胰島素放射免疫試劑盒檢測胰島素分泌量
　　 (5)Annexin V-PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率
　　 4、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。多組間資料比較當(dāng)滿足方差齊性時采用單向方差分析(One-way ANOVA)檢驗,各組均

16、數(shù)多重比較采用LSD法(Least-significant difference test)；若不滿足方差齊性時分別采用Welch法和Dunnett’s T3法。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 [結(jié)論]
　　 1、高糖誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞表達(dá)的IL-1β可能通過激活NF-κB通路造成細(xì)胞損傷。
　　 2、羅格列酮通過抑制NF-κB活化,減少胰島β細(xì)胞IL-1β的表達(dá)可能是其在高糖環(huán)境下保護(hù)胰島β細(xì)胞的機(jī)