缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）反義寡核苷酸對(duì)喉鱗癌荷瘤裸鼠模型化療（順鉑）增敏作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：確立應(yīng)用缺氧誘導(dǎo)因子-1a(HIF-1a)反義寡核苷酸聯(lián)合化療(順鉑)殺傷活體動(dòng)物模型體內(nèi)喉鱗狀細(xì)胞癌的各種條件和方法，為喉鱗癌基因治療的臨床前期研究提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1、喉鱗癌裸鼠模型的建立選擇Balb/c純系裸鼠70只，鼠齡3-4周齡，體重12-18g，均為雌性，于背部皮下注入2×106Hep-2細(xì)胞0.2ml，對(duì)照組注射PBS0.2ml。隔離室凈化空氣層流架中，恒溫恒濕，滅菌處理的飼料和水，供自由食用。當(dāng)腫瘤

2、長(zhǎng)至8-10mm時(shí)，用于實(shí)驗(yàn)。2、觀察不同化療劑量對(duì)荷瘤裸鼠的治療作用：將腫瘤長(zhǎng)至8-10mm的裸鼠25只隨機(jī)分為五組，每組5只，Ⅰ組1mg/kg，Ⅱ組2mg/kg，Ⅲ組3mg/kg，Ⅳ組4mg/kg，對(duì)照組為等量生理鹽水，采用腹腔注射，隔日1次。注射5次后殺鼠荷瘤取出后稱(chēng)重觀察抑瘤情況；部分放入70％的酒精中固定，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。3、在較適化療劑量下應(yīng)用HIF-1a反義寡核苷酸對(duì)腫瘤的抑制作用：將腫瘤長(zhǎng)至10mm的裸

3、鼠選擇成瘤較好的20只隨機(jī)分為四組：A組(正義+化療)，B組(反義+化療)，C組(化療)，D組(空白對(duì)照)，每次注射反義寡核苷酸100μg/只(按脂質(zhì)體：AS-ODN=1:1進(jìn)行包裹加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液，)，0.2ml向腫瘤基底部3點(diǎn)以及中央1點(diǎn)注射，隔日注射一次，共8次，前5次注射24小時(shí)后，給予荷瘤裸鼠順鉑3mg/kg腹腔注射，每2天測(cè)量一次鼠重、瘤體最大長(zhǎng)徑及最大垂直徑，在最后一次注射反義寡核苷酸24小時(shí)后將實(shí)驗(yàn)鼠脫頸處死，應(yīng)用流

4、式細(xì)胞儀、免疫組化、電鏡觀察腫瘤的抑瘤、凋亡情況及相關(guān)蛋白表達(dá)。 結(jié)果：1、注入2×106Hep-2細(xì)胞0.2ml后，48h開(kāi)始長(zhǎng)瘤，近3周長(zhǎng)至10mm大小。實(shí)驗(yàn)組60只裸鼠，成瘤率95％，殺鼠做病理示鱗狀細(xì)胞癌，分化三級(jí)。2、采用不同劑量的化療藥物進(jìn)行化療時(shí)，隨著化療藥物劑量的增加，腫瘤細(xì)胞的抑瘤率和凋亡率逐漸增加?；熕幬飫┝繛?mg/kg時(shí)，作用明顯而動(dòng)物的全身反應(yīng)不明顯，所以本實(shí)驗(yàn)選用3mg/kg為最適化療劑量。3、化療

5、聯(lián)合應(yīng)用HIF-1a反義寡核苷酸對(duì)腫瘤的抑制作用觀察結(jié)果瘤重的變化及抑瘤率：反義組瘤重最小，抑瘤率為(56.83±4.57)明顯高于空白對(duì)照、化療對(duì)照以及正義+化療對(duì)照3組(p＜0.01)；凋亡率及細(xì)胞周期：反義組凋亡率最大(44.750±5.710)明顯高于空白對(duì)照、化療對(duì)照以及正義對(duì)照3組(p＜0.01)。反義組細(xì)胞G0/G1期比例明顯低于其它3組，其它3組細(xì)胞阻滯在G0/G1期，S期和G2/M期細(xì)胞減少；免疫組化SP法染色顯示：H

6、IF-a、P53及VEGF在反義治療組表達(dá)較其它3組明顯較少；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示反義治療組的HIF-1a、P53、VEGF蛋白表FI值(0.905±0.141，0.773±0.128，0.848±0.068)明顯低于化療對(duì)照以及正義對(duì)照組(p＜0.01)。與免疫組化結(jié)果相符；超微結(jié)構(gòu)觀察：電鏡下反義+化療組可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮電子密度增加，邊集于核膜下，形成新月?tīng)罘Q(chēng)為半月，部分細(xì)胞膜亦可見(jiàn)球形膨出，線(xiàn)粒體體積增大，全部嵴和

7、部分膜融合或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，腔內(nèi)充滿(mǎn)分泌物，有脫顆粒現(xiàn)象。空白對(duì)照組可見(jiàn)細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞質(zhì)豐富，核橢圓形略不整形，常染色質(zhì)豐富，異染色質(zhì)少，有大而明顯的核仁。 結(jié)論：通過(guò)對(duì)活體裸鼠喉癌荷瘤模型，腹腔注射不同劑量化療藥物(順鉑)，各治療組均有抑瘤效果，但3mg/kg抑瘤效果明顯且動(dòng)物全身反應(yīng)不明顯，故3mg/kg為最適化療劑量；對(duì)活體裸鼠喉癌荷瘤模型，應(yīng)用化療聯(lián)合轉(zhuǎn)染缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1a)反義寡核苷酸，綜合大體標(biāo)本、