靶向載體介導(dǎo)hTERT反義寡核苷酸對(duì)人乳腺癌裸鼠的影響.pdf

1、乳腺癌是目前臨床中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在婦女惡性腫瘤中,其發(fā)病率居首位。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)及免疫學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,乳腺癌的基因治療已逐漸成為繼手術(shù)、放療、化療和內(nèi)分泌等傳統(tǒng)治療方法之后發(fā)展起來(lái)的一種新的治療手段。乳腺癌生物學(xué)特性復(fù)雜,惡性程度高,其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟、復(fù)雜的漸進(jìn)過(guò)程,而端粒酶(telomerase)的激活是其中重要的一環(huán)。在近90％人腫瘤細(xì)胞中端粒酶呈高表達(dá),而在絕大多數(shù)正常體細(xì)胞中端粒酶不表達(dá),所以端

2、粒酶成為了公認(rèn)的最重要的腫瘤標(biāo)志物之一。人端粒酶的三種亞單位成分:人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)、端粒酶相關(guān)蛋白Ⅰ(telomeraseassociated protein,TPI)、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)當(dāng)中,hTERT是端粒酶活性的限速亞單位,它對(duì)端粒酶的活性調(diào)控起著決定性作用,因而hTERT也成為了靶向端粒酶抗

3、癌策略的理想靶點(diǎn)。研究表明,利用靶向hTERT的反義寡脫氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)可抑制端粒酶活性及腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。但是,未經(jīng)修飾的裸ASODN在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)極易被血液中的核酸酶降解,而無(wú)法發(fā)揮其作用。為此,國(guó)內(nèi)外研究者們嘗試?yán)酶鞣N病毒或非病毒基因載體來(lái)保護(hù)和攜帶寡核苷酸,以解決在體內(nèi)其容易被降解而不能穩(wěn)定存在的難題,增加進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的反義核酸的量,提高其穩(wěn)定性,確保

4、其生物學(xué)效應(yīng)。聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)是近年來(lái)興起的一種極具應(yīng)用潛能的非病毒基因載體,它可以把ASODN縮合成納米級(jí)的顆粒狀物,極大地提高轉(zhuǎn)染效率。但是,PEI/ASODN納米粒在體內(nèi)應(yīng)用時(shí),會(huì)迅速地被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)清除而降低轉(zhuǎn)染效率;此外PEI還具有一定的細(xì)胞毒性。脂質(zhì)體(liposome)具有無(wú)毒、無(wú)免疫原性、且具有組織相似性和相溶性等優(yōu)點(diǎn),用脂質(zhì)體來(lái)包裹PEI/DNA壓縮體制成LPD(liposom

5、e-PEI/DNA)復(fù)合物,能更好地保護(hù)、屏蔽PEI/ASODN壓縮體。NGR(N:天冬酰氨酸,G:氨基乙酸,R:精氨酸)多肽序列可以與腫瘤新生血管受體CD13特異性結(jié)合,具有很強(qiáng)的腫瘤靶向性。本研究中采用的CNGRCK2HK3HK11多肽中的半胱氨酸(C)含有巰基(-SH),可以與LPD表面的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)發(fā)生反應(yīng),從而達(dá)到靶向修飾的目的,得到具有腫瘤靶向功能的LPD復(fù)合物(NGR/LPD)來(lái)保護(hù)、靶向運(yùn)載ASODN。
　　本研

6、究以hTERT為靶點(diǎn),設(shè)計(jì)合成針對(duì)此靶點(diǎn)mRNA的反義寡核苷酸,制備了NGR修飾的脂質(zhì)體-聚陽(yáng)離子-ASODN復(fù)合物(NGR/LPD),另外制備脂質(zhì)體-聚陽(yáng)離子-ASODN復(fù)合物(LPD)、B-PEI/ASODN縮合體(PEI/ASODN)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照,經(jīng)過(guò)尾緣靜脈注射入荷瘤裸鼠體內(nèi),觀察制劑在體內(nèi)對(duì)MCF-7細(xì)胞的hTERT基因、蛋白表達(dá)的影響、腫瘤細(xì)胞凋亡情況和相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)變化及對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　方法:1.NG

7、R/LPD、PEI/ASODN、LPD復(fù)合物的制備。2.NGR/LPD相關(guān)性質(zhì)的考察。3.NGR/LPD復(fù)合物的體內(nèi)活性研究。BALB/c裸鼠皮下注射人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞懸液,建立人乳腺癌動(dòng)物模型。3.1體內(nèi)藥物分布實(shí)驗(yàn),共分為4組,每組3只裸鼠。實(shí)驗(yàn)組Ⅰ經(jīng)尾緣靜脈給予ASODN-FAM復(fù)合物200μl實(shí)驗(yàn)組Ⅱ經(jīng)尾緣靜脈給予PEI/ASODN-FAM復(fù)合物200μl實(shí)驗(yàn)組Ⅲ經(jīng)尾緣靜脈給予FAM標(biāo)記LPD復(fù)合物200μl實(shí)驗(yàn)組Ⅳ經(jīng)

8、尾緣靜脈給予FAM標(biāo)記NGR/LPD復(fù)合物200μl分別于給藥后1、3、6小時(shí)后短頸處死裸鼠,立即取出肝、腎、肺、脾和瘤體組織,冰凍切片,激光共聚焦顯微鏡下觀察各組織的藥物分布情況。3.2抑瘤實(shí)驗(yàn)分組,共分為9組,每組5只裸鼠。空白對(duì)照組:經(jīng)尾緣靜脈給予生理鹽水200μl反義核酸組:經(jīng)尾緣靜脈給予ASODN溶液200μl正義NGR/LPD組:經(jīng)尾緣靜脈給予SODN制備的正義NGR/LPD混懸液200μlPEI/ASODN高劑量組:經(jīng)尾緣

9、靜脈給予PEI/ASODN混懸液200μlPEI/ASODN低劑量組:經(jīng)尾緣靜脈給予PEI/ASODN混懸液100μlLPD高劑量組:經(jīng)尾緣靜脈給予LPD混懸液200μlLPD低劑量組:經(jīng)尾緣靜脈給予LPD混懸液100μlNGR/LPD高劑量組:經(jīng)尾緣靜脈給予NGR/LPD混懸液200μlNGR/LPD低劑量組:經(jīng)尾緣靜脈給予NGR/LPD混懸液100μl各實(shí)驗(yàn)組裸鼠隔天給藥一次,連續(xù)給藥三周。每三天測(cè)定瘤體大小一次,測(cè)定三周。計(jì)算移植

10、瘤的體積,繪制生長(zhǎng)曲線。4.移植瘤組織、各臟器作常規(guī)病理切片,顯微鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)改變。5.免疫組化技術(shù)檢測(cè)移植瘤hTERT蛋白以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2,C-myc蛋白表達(dá)情況。6.采用半定量RT-PCR法檢測(cè)瘤組織hTERT mRNA的表達(dá)情況。7.采用TUNEL法原位檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞凋亡情況。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析,數(shù)據(jù)用(±s)表示,α=

11、0.05作為差別有顯著性的檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:1.經(jīng)過(guò)一系列相關(guān)考察驗(yàn)證,證實(shí)NGR/LPD是形態(tài)規(guī)整的近球形復(fù)合物,平均粒徑在178nm左右,平均zeta電位近中性;可長(zhǎng)期穩(wěn)定存放;對(duì)ASODN的包裹效果好;具備NGR多肽的腫瘤靶向修飾。2.體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:四種制劑經(jīng)靜脈注射進(jìn)入體內(nèi)后都部分地被肝、腎、肺和脾等臟器攝取、截留,但在瘤體中的它們的分布情況則明顯不同:ASODN、PEI/ASODN和LPD組瘤體組織中僅能觀察

12、到微弱的熒光,而在NGR/LPD組裸鼠瘤體中的熒光強(qiáng)度則明顯強(qiáng)于前三組,而且注射后1、3、6小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察其熒光強(qiáng)度在逐步增強(qiáng),表明NGR/LPD復(fù)合物可以有效進(jìn)入到瘤體組織,而且會(huì)不斷地向瘤體組織富集。3.移植瘤的生長(zhǎng)情況觀察:藥物治療3周后,觀測(cè)NGR/LPD組的瘤體生長(zhǎng)明顯受到抑制,與其它各組具有顯著差異。4.免疫組織化學(xué)結(jié)果:與生理鹽水組相比較,NGR/LPD組hTERT蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01,P<0.05),高、低

13、劑量組間存在明顯差異(P<0.05)。NGR/LPD與LPD、PEI/ASODN相同劑量組間比較有明顯差異(P<0.05)。LPD、PEI/ASODN縮合體組染色得分值雖然不同程度降低,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),ASODN和正義組與空白對(duì)照對(duì)比無(wú)明顯差異(P>0.05)。NGR/LPD高劑量組C-myc蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)、Bcl-2表達(dá)則明顯降低(P<0.05),NGR/LPD低劑量組C-myc及Bcl-2蛋白表達(dá)變

14、化不明顯(P>0.05),NGR/LPD高、低劑量組間存在明顯差異(P<0.05),其余各組變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。5.各組瘤組織hTERT mRNA檢測(cè)結(jié)果:NGR/LPD組hTERT mRNA水平與生理鹽水組比較明顯降低(P<0.01,P<0.05),且高、低劑量組間比較有顯著性差異(P<0.05)。PEI/ASODN、LPD高劑量組灰度值有不同程度降低,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。NGR/LPD與LPD、PEI/A

15、SODN相同劑量組間比較有明顯差異(P<0.05)。ASODN和正義組與空白對(duì)照對(duì)比無(wú)明顯差異(P>0.05)。6.細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果:各對(duì)照組偶見(jiàn)或少見(jiàn)凋亡細(xì)胞,NGR/LPD復(fù)合物高劑量組和NGR/LPD低劑量組凋亡細(xì)胞明顯增多,凋亡指數(shù)明顯增多(P<0.01,P<0.05),NGR/LPD高劑量組可見(jiàn)TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞呈小片狀分布。NGR/LPD高、低劑量組間比較有明顯差異(P<0.05)。NGR/LPD與LPD、PEI/AS

16、ODN相同劑量組間比較有明顯差異(P<0.05)。LPD、PEI/ASODN縮合體組得分值有不同程度升高,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),ASODN和正義組與空白對(duì)照對(duì)比無(wú)明顯差異(P>0.05)。7.對(duì)瘤體組織HE染色進(jìn)行鏡下觀察時(shí)發(fā)現(xiàn):對(duì)照組瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活躍,可見(jiàn)瘤巨細(xì)胞,散在有點(diǎn)、片狀壞死灶。實(shí)驗(yàn)(NGR/LPD高劑量)組可見(jiàn)瘤細(xì)胞瘤細(xì)胞間質(zhì)纖維化較明顯,可見(jiàn)大片壞死灶。在對(duì)裸鼠各臟器HE染色進(jìn)行鏡下觀察時(shí)發(fā)現(xiàn):PEI/ASODN高

17、劑量組部分裸鼠肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)大量漿液滲出,肺泡隔變寬。PEI/ASODN低劑量組及其它各組未見(jiàn)異常。
　　結(jié)論:1.本研究制備的復(fù)合型腫瘤靶向脂質(zhì)復(fù)合物(NGR/LPD)具有粒徑小、均一、無(wú)毒,對(duì)ASODN包封效果好,能夠穩(wěn)定保存等特點(diǎn)。2.以hTERT為靶點(diǎn)人工合成的ASODN可特異地抑制hTERT mRNA的表達(dá)和端粒酶活性,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。3.NGR/LPD能夠隨著血液循環(huán)靶向運(yùn)載ASODN到達(dá)靶組織腫瘤細(xì)胞內(nèi),可以有效抑制