缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）反義寡核苷酸對(duì)裸鼠人喉鱗癌移植瘤放療增敏作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：確立應(yīng)用缺氧誘導(dǎo)因子-1a(HIF-1a)反義寡核苷酸結(jié)合放射應(yīng)用殺傷喉鱗狀細(xì)胞癌的各種條件和方法，為喉鱗癌的基因治療開(kāi)辟新途徑。 方法 1 喉鱗癌裸鼠模型的建立選擇Balb/c純系裸鼠80只，鼠齡3-4周齡，體重12-18g，均為雌性，于背部皮下注入2×10<'6>Hep-2細(xì)胞0.2ml，對(duì)照組注射PBS0.2ml。隔離室凈化空氣層流架中，恒溫恒濕，滅菌處理的飼料和水，供自由食用。當(dāng)腫瘤長(zhǎng)至8-10mm時(shí)，用于

2、實(shí)驗(yàn)。 2 觀察不同放射劑量對(duì)荷瘤裸鼠的抑制作用：將腫瘤長(zhǎng)至8-10mm的裸鼠30只隨機(jī)分為六組，每組5只，Ⅰ組2Gy，Ⅱ組5Gy，Ⅲ組10Gy，Ⅳ組15Gy，Ⅴ組20Gy，對(duì)照組為0Gy，采用局部分割照射，每次2Gy。照射10天后殺鼠荷瘤取出后稱重觀察抑瘤情況；部分放入70％的酒精中固定，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 3 在較適放射劑量下應(yīng)用HIF-1a反義寡核苷酸對(duì)腫瘤的抑制作用：將腫瘤長(zhǎng)至10mm的裸鼠選擇成

3、瘤較好的25只隨機(jī)分為五組：A組(正義+10Gy)，B組(反義+10Gy)C組(空脂質(zhì)體+10Gy)D組(10Gy)E組(空白對(duì)照)，每次注射10μh/只(按脂質(zhì)體：DNA=1：1進(jìn)行包裹加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液，)，0．2ml向腫瘤基底部3點(diǎn)以及中央1點(diǎn)注射，每3天注射一次，共8次，每次注射后6小時(shí)，對(duì)裸鼠腫瘤行Co60局部放射2Gy，每3天測(cè)量一次鼠重、瘤體最大長(zhǎng)徑及最大垂直徑，治療21天后將實(shí)驗(yàn)鼠脫頸處死，應(yīng)用流式細(xì)胞儀、免疫組化、電

4、鏡觀察腫瘤的，觀察抑瘤、凋亡情況及相關(guān)蛋白表達(dá)。 結(jié)果:1 注入2×10<'6>Hep-2細(xì)胞0.2ml后，48h開(kāi)始長(zhǎng)瘤，近3周長(zhǎng)至10mm大小。實(shí)驗(yàn)組70只裸鼠，7只成瘤彌散，3只未長(zhǎng)瘤，0只死亡，2只注入PBS未成瘤，成瘤率95.71％，殺鼠做病理示鱗狀細(xì)胞癌，分化三級(jí)。 2 不同放療劑量組：空白組、2Gy組、5Gy組、10Gy組、15Gy組的抑瘤率分別為0、2.841％、9.817％、19.201％、27.822

5、％。經(jīng)單因素方差分析(P<0.01)。結(jié)果說(shuō)明隨著放療劑量增加，抑瘤率也隨之增加，20Gy組因照射劑量較大，裸鼠全部死亡，15Gy組裸鼠皮膚蒼白并出現(xiàn)較多紅色出血點(diǎn)，裸鼠食量減弱，體重減輕。各組凋亡率分別為12.474±3.009％；12.982±4.064％； 15.922±3.840％； 19.768±2.602％；24.362±2.131％經(jīng)Kruskal Wallis Test， Mean Score分別為11.10 16.40

6、 10.50 4.00(Chi-square 16.209 P<0.01)。結(jié)果說(shuō)明隨著放療劑量的增加，瘤細(xì)胞凋亡率也增加，故選用10Gy為最適放療劑量。 3 在較適放射劑量下應(yīng)用HIF-1a反義寡核苷酸對(duì)腫瘤的抑制作用觀察結(jié)果3.1 瘤重的變化及抑瘤率：反義組瘤重最小，抑瘤率為(50.21±8.10)明顯高于空白對(duì)照、脂質(zhì)體對(duì)照、放療對(duì)照以及正義對(duì)照4組(p<0.05)3.2 凋亡率及增殖指數(shù)：反義組凋亡率最大(34.522±

7、4.159％)增殖指數(shù)(41.642±3.596％)明顯高于空白對(duì)照、脂質(zhì)體對(duì)照、放療對(duì)照以及正義對(duì)照4組(凋亡率p<0.05，增殖指數(shù)Kruskal-Wallis Test Chi-Square=16.084 P<0.01)3.3 免疫組化PV法染色顯示：HIF-a正義組胞漿有大量棕色顆粒沉積著色，而反義治療組表達(dá)較少；正義對(duì)照組P53表達(dá)于胞核呈棕色顆粒濃染，而反義治療組表達(dá)較少；VEGF正義對(duì)照組胞漿有大量棕色顆粒沉積著色，而反義

8、治療組表達(dá)較少。 3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示反義治療組的HIF-1a、P53、VEGF蛋白表FI值(0.98±0.28，2.13±0.03，1.09±0.36)明顯低于空白對(duì)照、脂質(zhì)體對(duì)照、放療對(duì)照以及正義對(duì)照4組(p<0.05)。 3.5 電鏡結(jié)果電鏡下見(jiàn)空脂質(zhì)體+放療組、正義+放療組、反義+放療組核膜呈銳角突起，核染色質(zhì)濃縮，電子密度增加邊集于核模下，有的形成半月(Fig17)。線粒體空泡化明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒

9、?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞質(zhì)豐富，核橢圓形略不整形，常染色質(zhì)豐富，異染色質(zhì)少，有大而明顯的核仁，線粒體輕度空化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度脫顆粒。放療組變性壞死為細(xì)胞核的碎片。線位體局部水腫，空泡化，部分和大部分嵴融合、消失，部分和大部分膜消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒。反義+放療組喉鱗癌細(xì)胞局部核膜呈銳角突起，核染色質(zhì)濃縮電子密度增加，邊集于核膜下，形成新月?tīng)罘Q為半月，部分細(xì)胞膜亦可見(jiàn)球形膨出。線粒體輕度水腫，部分峭排列紊亂，部分嵴消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有