姜黃素干預(yù)AFB1致肉雞亞慢性肝損傷的分子機制.pdf

1、黃曲霉毒索B1(aflatoxin B1，AFB1)是畜禽飼料中最常見的致癌污染物。肉雞AFB1中毒事件頻頻發(fā)生，除了能影響肉雞生長效率、繁殖力等，還會因其免疫抑制作用導(dǎo)致中毒雞只對多種傳染病易感性增強，加大其患病率和死亡率;同時，飼料中的AFB1及其代謝物可以蓄積在肉雞的肝臟、腎臟和肌肉組織中，人食入后可引起慢性中毒甚至癌癥，對畜牧業(yè)、公共衛(wèi)生和人體健康威脅極大。目前關(guān)于AFB1致肉雞亞慢性肝損傷的機制尚不完全明確。
　　姜黃索

2、是從姜科和天南星科植物根莖中提取的二酮類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用。近期研究發(fā)現(xiàn)姜黃索在脂肪肝、肝炎、肝硬化、肝癌等疾病中具有肝保護作用，然而其對AFB1誘導(dǎo)的肉雞亞慢性肝損傷的保護效果及其分子機制尚不明確。
　　AA肉雞是中國市場占有量最大的肉雞品種。本研究以1日齡AA肉雛雞為實驗動物，建立AFB1亞慢性肝損傷模型并應(yīng)用不同劑量姜黃素干預(yù)，采用DNA/RNA染色、透射電鏡和Western Blot、Real Time

3、-PCR等先進分子生物學(xué)技術(shù)，探討AFB1亞慢性暴露對肉雞肝臟細(xì)胞自噬、凋亡、炎癥和增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響以及TLR4/NF-κB通路在此過程中扮演的角色，探明姜黃素能否通過影響白噬、凋亡、炎癥和增殖相關(guān)基因表達(dá)干預(yù)AFB1致肉雞亞慢性肝損傷及其干預(yù)效果的可持續(xù)性。
　　形態(tài)學(xué)和超微形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果:AFB1連續(xù)暴露28天，與空白對照組（C組）相比，透射電鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，AFB1染毒組（A組）肝細(xì)胞自噬小體罕見，線粒體結(jié)構(gòu)

4、紊亂、嵴斷裂，細(xì)胞核染色質(zhì)邊集化;采用姜黃素連續(xù)干預(yù)28天，低劑量姜黃素（L組）對上述病理改變干預(yù)效果不明顯，中（M組）、高（H組）劑量姜黃索干預(yù)明顯改善上述病理變化，H組肝細(xì)胞自噬小體重新出現(xiàn)，細(xì)胞核染色質(zhì)分布均勻，線粒體結(jié)構(gòu)清晰;姜黃素對照組（CC組）肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)未見異常。肝組織切片DNA/RNA染色及凋亡和壞死細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示，A組凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P＜0.01)，姜黃素干預(yù)能劑量依賴性減少凋亡、壞死細(xì)胞數(shù)（L、M、H

5、組，P＜0.01），CC組未見明顯異常。停止暴露AFB1和姜黃素干預(yù)7天后，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，A組肝細(xì)胞自噬小體罕見，細(xì)胞核染色質(zhì)聚集或邊集，線粒體嵴結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞間隙出現(xiàn)纖維樣物質(zhì)。其它各組中除L組肝細(xì)胞核仍有輕微的染色質(zhì)聚集以外，各組肝細(xì)胞溶酶體活動性強，自噬現(xiàn)象明顯，細(xì)胞核染色質(zhì)分布均勻，線粒體結(jié)構(gòu)清晰。DNA/RNA染色及凋亡和壞死細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示，A組凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)明顯多于C組(P＜0.01)，姜黃素干預(yù)組凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)較

6、A組劑量依賴性減少(P＜0.01)，CC組較C組無明顯差異。說明姜黃素能有效干預(yù)AFB1亞慢性暴露誘發(fā)的肝細(xì)胞自噬抑制和凋亡、壞死增加，而且姜黃素的干預(yù)效果在停藥7天內(nèi)具有持續(xù)性。
　　自噬相關(guān)蛋白、基因檢測結(jié)果:AFB1連續(xù)暴露28天，與C組比較，A組肝臟LC3a蛋白表達(dá)、LC3b-Ⅱ/LC3b-Ⅰ比值和beclin-1 mRNA表達(dá)顯著減少(P＜0.01)，mTOR蛋白、mRNA以及肝細(xì)胞質(zhì)P53蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.01

7、)。姜黃素連續(xù)干預(yù)28天，與A組比較，姜黃素干預(yù)組LC3a蛋白表達(dá)、LC3b-Ⅱ/LC3b-Ⅰ比值、beclin-1mRNA表達(dá)明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)，mTOR蛋白、mRNA以及細(xì)胞質(zhì)P53蛋白表達(dá)量明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）。CC組與C組比較，LC3b-Ⅱ/LC3b-Ⅰ比值和beclin-1 mRNA表達(dá)水平升高(P＜0.01)。停毒停藥7天后，各組肝臟上述各指標(biāo)變化趨勢與28天相似，僅CC組各項指標(biāo)與C組

8、無統(tǒng)計學(xué)差異。說明姜黃素可能通過促進beclin-1表達(dá)、抑制mTOR和細(xì)胞質(zhì)P53表達(dá)誘導(dǎo)LC3a和LC3b-Ⅱ/LC3b-Ⅰ水平增加進而干預(yù)AFB1亞慢性暴露引起的肝細(xì)胞自噬抑制，而且其干預(yù)作用在停藥7天內(nèi)具持續(xù)性。
　　凋亡相關(guān)蛋白、基因檢測結(jié)果:AFB1連續(xù)暴露28天，與C組比較，A組肝臟Caspase-3、Bax、細(xì)胞核P53蛋白、p53 mRNA、bcl-2 mRNA表達(dá)量顯著增加(P＜0.01)。姜黃索連續(xù)干預(yù)28天

9、，與A組相比，姜黃素干預(yù)組bcl-2 mRNA表達(dá)劑量依賴性增加（P＞0.05或P＜0.01），其它各指標(biāo)均呈劑量依賴性降低（P＞0.05或P＜0.05或P＜0.01）。CC組較C組bcl-2 mRNA表達(dá)增加(P＜0.01)。停毒停藥7天后，與C組比較，A組除bcl-2 mRNA表達(dá)下降(P＜0.01)以外，其它各指標(biāo)變化趨勢與28天相同（P＜0.05或P＜0.01）。與A組比較，姜黃素干預(yù)組各指標(biāo)變化趨勢與28天相同（P＞0.05或

10、P＜0.05或P＜0.01）。CC組與C組比較其細(xì)胞核P53蛋白、p53 mRNA、caspase-3mRNA、Bax蛋白表達(dá)水平明顯下降(P＜0.01)，bcl-2 mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.01)。說明抑制促凋亡基因、蛋白表達(dá)并促進抗凋亡基因的表達(dá)可能是姜黃素干預(yù)AFB1亞慢性暴露誘導(dǎo)的肉雞肝細(xì)胞凋亡的重要分子機制，而且姜黃索的干預(yù)效果在停藥7天內(nèi)具有持續(xù)性。
　　炎癥和細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)及TLR4/NF-κB通路活性檢

11、測結(jié)果:AFB1連續(xù)暴露28天，與C組比較，A組肝臟TNF-α、cyclin D1、IL-10、HO-1 mRNA表達(dá)及細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），TLR4蛋白、細(xì)胞核NF-κB p65蛋白以及TGF-β、IL-1β、IL-6、IL-8、TLR4、NF-κB p65 mRNA表達(dá)增加(P＜0.01)。姜黃素連續(xù)干預(yù)28天，相比于A組，姜黃素干預(yù)組TNF-α、cyclin D1、TGF-β、IL

12、-10、HO-1 mRNA表達(dá)以及細(xì)胞質(zhì)NF-κBp65蛋白表達(dá)增加（P＞0.05或P＜0.05或P＜0.01），TLR4蛋白、細(xì)胞核NF-κB p65蛋白以及IL-1β、IL-6、IL-8、TLR4、NF-κB p65 mRNA表達(dá)量減少（P＜0.05或P＜0.01）。CC組較C組TNF-α、cyclin D1、TGF-β、IL-10、HO-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)，TLR4蛋白和NF-κB p65 mRNA表達(dá)水

13、平顯著降低(P＜0.01)。停毒停藥后第7天，與C組比較，A組除cyclin D1和TGF-β mRNA表達(dá)無變化以外，其它各項指標(biāo)變化趨勢均與28天相同(P＜0.01)。與A組相比，姜黃素干預(yù)組各指標(biāo)變化趨勢與28天相似(P＞0.05或P＜0.05或P＜0.01)，僅TGF-β mRNA表達(dá)無明顯變化。CC組與C組比較，TNF-α、cyclin D1、IL-10 mRNA表達(dá)增加(P＜0.01），TLR4蛋白和基因以及細(xì)胞核NF-κB