骨橋蛋白對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及遷移功能的影響研究.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)分別利用OPN慢病毒及蛋白處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測(cè)內(nèi)源性及外源性 OPN表達(dá)差異導(dǎo)致的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及遷移功能的變化，從而比較OPN對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能的影響。
　　方法：
　　1.分別分離培養(yǎng)新生OPN基因敲除型及野生型C57BL/6小鼠(鼠齡一天)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。培養(yǎng)后行流式、PCR、WB鑒定；
　　2.提取野生型成年小鼠OPN基因后構(gòu)建OPN質(zhì)粒并通過(guò)氯化鈣-氯喹法進(jìn)行慢病毒

2、包裝；
　　3.慢病毒感染細(xì)胞，并行定量PCR及WB檢測(cè)各細(xì)胞內(nèi)OPN表達(dá)量的變化。
　　4.分別利用外源性O(shè)PN蛋白及OPN慢病毒處理細(xì)胞后用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力改變。
　　5.同樣分組利用Transwell小室檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力變化。
　　結(jié)果：
　　1.鏡下見(jiàn)骨髓內(nèi)分離的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，呈漩渦狀排列。流式細(xì)胞儀檢測(cè)示細(xì)胞純度高，PCR、WB鑒定結(jié)果顯示OPN基因敲除型小鼠無(wú)OPN基

3、因及蛋白的表達(dá)，而野生型小鼠可正常表達(dá)；
　　2.從成年小鼠腎臟提取的OPN基因長(zhǎng)度約為900bp。將此基因片段插入慢病毒載體后，經(jīng)氯化鈣-氯喹方法進(jìn)行質(zhì)粒包裝后獲得滴度為2.5×108TU/ml的含OPN基因片段的慢病毒及空載體慢病毒；
　　3.慢病毒分別感染基因敲除型及野生型小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后熒光鏡下可細(xì)胞均有熒光產(chǎn)生，經(jīng)定量PCR及WB檢測(cè)OPN呈梯度表達(dá)；
　　4.CCK8檢測(cè)結(jié)果提示無(wú)論是外源性 OPN