外源性骨橋蛋白對肝再生中細(xì)胞增殖的作用研究(1)

1、硼||||||】||l|||||||||l|lI【llI，|l《■灌’4：，4●吁：：河南衙瓢大孝碩士學(xué)位論文外源性骨橋蛋白對肝再生中細(xì)胞增殖的作用研究學(xué)科、專業(yè)研究方向申請學(xué)位類別申請人指導(dǎo)教師：生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué)：細(xì)胞分化調(diào)控：理學(xué)碩士：陳莎莎：王改平副教授二O一七年五月摘要IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIY3262028目的骨橋蛋白(Ostepontin，OPN)作為一種多功能蛋白，能夠參與多種病理活動，如參與各種組織中的炎

2、癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、血管生成、纖維化和癌癥等的發(fā)生。大量的研究已闡明OPN在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、炎癥反應(yīng)、纖維化和癌癥進(jìn)展等過程中具有重要作用。我們在前期研究發(fā)現(xiàn)，肝再生與細(xì)胞增殖、活化和炎癥反應(yīng)等生理活動密切相關(guān)，然而目前關(guān)于OPN在肝再生中的作用機(jī)制尚未闡明。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，分別從體內(nèi)和體外研究外源性O(shè)PN對大鼠肝再生的影響。方法在體外研究中，分別用大鼠重組OPN蛋白(recombinantratOPN，rrOPN)和小

3、鼠OPN抗體(MouseOsteopontinAntibodymOPNAb)處理大鼠肝細(xì)胞BRL3A，MTT檢測細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布情況，qRTPCR和WesternBlot方法檢測OPN通路相關(guān)基因和受通路調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖相關(guān)靶基因的表達(dá)變化。在體內(nèi)研究中，首先將rrOPN通過尾靜脈注入2／3肝切除后的大鼠體內(nèi)，分別于3h、24h和72h后取材，測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanineaminotransferase，A

4、LT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate鋤i南transferase，AST)的含量，ELISA方法檢測血清中IL6和n旺伐的含量，H&E染色檢測再生肝組織學(xué)變化，免疫熒光檢測再生肝組織中細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA的表達(dá)水平，qRTPCR和WesternBlot方法檢測OPN通路相關(guān)基因及受通路調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖相關(guān)靶基因的表達(dá)變化。結(jié)果體外研究發(fā)現(xiàn)，rrOPN可能通過促進(jìn)其受體CD44和ITGAV的表達(dá)，從而激活下游的JAK／STAT、ERKl

5、／2和P13K／AKT信號通路，調(diào)節(jié)下游靶基因／蛋白CCNDl、BCL2和BAX的表達(dá)，參與調(diào)控肝細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。而OPNAb則通過抑制其下游信號通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制肝細(xì)胞增殖。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，rrOPN能夠顯著增加部分肝切除后3h血清中IL一6和TNF0c的含量，HE染色結(jié)果顯示，rrOPN在部分肝切除后24h再生肝組織炎癥反應(yīng)明顯，72h肝組織中細(xì)胞核的數(shù)目顯著增多；免疫熒光檢測結(jié)果顯示，rrOPN在部分肝切除