外源性骨橋蛋白對肝再生中細胞增殖的作用研究(1)

1、硼||||||】||l|||||||||l|lI【llI，|l《■灌’4：，4●吁：：河南衙瓢大孝碩士學位論文外源性骨橋蛋白對肝再生中細胞增殖的作用研究學科、專業(yè)研究方向申請學位類別申請人指導教師：生物學細胞生物學：細胞分化調控：理學碩士：陳莎莎：王改平副教授二O一七年五月摘要IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIY3262028目的骨橋蛋白(Ostepontin，OPN)作為一種多功能蛋白，能夠參與多種病理活動，如參與各種組織中的炎

2、癥反應、免疫反應、血管生成、纖維化和癌癥等的發(fā)生。大量的研究已闡明OPN在調節(jié)細胞增殖、遷移、炎癥反應、纖維化和癌癥進展等過程中具有重要作用。我們在前期研究發(fā)現(xiàn)，肝再生與細胞增殖、活化和炎癥反應等生理活動密切相關，然而目前關于OPN在肝再生中的作用機制尚未闡明。因此，本實驗在前期研究基礎上，分別從體內和體外研究外源性OPN對大鼠肝再生的影響。方法在體外研究中，分別用大鼠重組OPN蛋白(recombinantratOPN，rrOPN)和小

3、鼠OPN抗體(MouseOsteopontinAntibodymOPNAb)處理大鼠肝細胞BRL3A，MTT檢測細胞增殖情況，流式細胞術檢測細胞周期分布情況，qRTPCR和WesternBlot方法檢測OPN通路相關基因和受通路調節(jié)的細胞增殖相關靶基因的表達變化。在體內研究中，首先將rrOPN通過尾靜脈注入2／3肝切除后的大鼠體內，分別于3h、24h和72h后取材，測定血清中谷丙轉氨酶(Alanineaminotransferase，A

4、LT)和谷草轉氨酶(Aspartate鋤i南transferase，AST)的含量，ELISA方法檢測血清中IL6和n旺伐的含量，H&E染色檢測再生肝組織學變化，免疫熒光檢測再生肝組織中細胞增殖標志物PCNA的表達水平，qRTPCR和WesternBlot方法檢測OPN通路相關基因及受通路調節(jié)的細胞增殖相關靶基因的表達變化。結果體外研究發(fā)現(xiàn)，rrOPN可能通過促進其受體CD44和ITGAV的表達，從而激活下游的JAK／STAT、ERKl

5、／2和P13K／AKT信號通路，調節(jié)下游靶基因／蛋白CCNDl、BCL2和BAX的表達，參與調控肝細胞周期進程，促進肝細胞增殖。而OPNAb則通過抑制其下游信號通路中相關蛋白的表達，從而抑制肝細胞增殖。體內研究發(fā)現(xiàn)，rrOPN能夠顯著增加部分肝切除后3h血清中IL一6和TNF0c的含量，HE染色結果顯示，rrOPN在部分肝切除后24h再生肝組織炎癥反應明顯，72h肝組織中細胞核的數(shù)目顯著增多；免疫熒光檢測結果顯示，rrOPN在部分肝切除