過表達(dá)RIP3增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)小白菊內(nèi)酯的敏感性的作用機(jī)制研究.pdf

1、分類號(hào)：R73057密級(jí)：學(xué)位類別：科學(xué)學(xué)位團(tuán)專業(yè)學(xué)位口◇學(xué)校代碼：10062學(xué)號(hào)：2011602486學(xué)科門類：醫(yī)學(xué)又坪簣科鼻辱TlAlIJl麓■EDlCALU麓IV蠢曬nN碩士學(xué)位論文MASTER’SDISSERTIATION論文題目：過表達(dá)RIP3增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)小白菊內(nèi)酯的敏感性的作用機(jī)制研究TITLEOverexpressionofRIP3sensitizeshumanbreastcancercellstoparthenoli

2、de—inducedapoptosis一級(jí)學(xué)科：臨床醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科：腫瘤學(xué)論文作者：路燦指導(dǎo)教師：佟仲生教授天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二。一四年五月天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要目的：構(gòu)建含有RIP3基因的真核表達(dá)載體，研究過表達(dá)RIP3基因?qū)π“拙諆?nèi)酯抗乳腺癌細(xì)胞作用的影響及機(jī)制。為其作為抗乳腺癌新藥的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。方法：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)檢測(cè)及比較4株人乳腺癌細(xì)胞系MCF7，MDAMB231，MDAMB435，T47

3、D及正常人乳腺上皮細(xì)胞MCFl0A中RIP3mRNA的表達(dá)水平。以正常人乳腺上皮細(xì)胞MCFl0A反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，PCR擴(kuò)增RIP3基因cDNA全長(zhǎng)，將合成的RIP3基因克隆入mCherry載體的N末端，構(gòu)建重組質(zhì)粒mCherryRIP3，測(cè)序證實(shí)mCherryRIP3重組質(zhì)粒構(gòu)建正確與否。通過慢病毒法構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)RIP3的MCF7及MDAMB23l乳腺癌細(xì)胞株。熒光顯微鏡下觀察mCherryRIP3蛋白在MCF7及MDAMB23

4、1細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效率及定位。RTPCR及WesternBlot檢測(cè)目的基因RIP3在MCF一7及MDAMB23l細(xì)胞內(nèi)mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。用不同濃度小白菊內(nèi)酯分別處理過表達(dá)RIP3及表達(dá)空載體乳腺癌細(xì)胞，顯微鏡下觀察不同處理組乳腺癌細(xì)胞形態(tài)的變化，熒光顯微鏡下觀察不同處理組乳腺癌細(xì)胞核形態(tài)的改變，MTT比色法檢測(cè)不同處理組乳腺癌細(xì)胞增殖的變化及量效關(guān)系，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，WesternBlot檢測(cè)

5、PARP蛋白及其裂解片段表達(dá)水平，小白菊內(nèi)酯處理細(xì)胞的同時(shí)加用抗氧化劑NAC(N乙酰半胱氨酸，N—acetyl—Lcysteine)，MTT法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞增殖的變化。結(jié)果：1RTPCR檢測(cè)到MCF一7，MDAMB231，MDlA—MB435，T47D細(xì)胞中砌P3基因普遍低表達(dá)，但在正常乳腺癌細(xì)胞MCFl0A中高表達(dá)。2重組載體測(cè)序鑒定該序列與GenBank中的序列相同。獲得外源性RIP3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的乳腺癌MCF7及MDAMB231細(xì)胞株

6、，熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光蛋白表達(dá)率達(dá)90％以上，并且定位于胞質(zhì)。RTPCR及WesternBlot檢測(cè)到目的基因RIP3在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中為過表達(dá)。3隨著小白菊內(nèi)酯濃度的增加，MCF7及MBAMB231細(xì)胞逐漸縮小變圓，細(xì)胞膜邊界不清、胞膜破裂、細(xì)胞溶解死亡，與表達(dá)空載體MCF7及MBA—MB一23l細(xì)胞相比過表達(dá)RIP3細(xì)胞出現(xiàn)上述形態(tài)變化較明顯。另外，過表達(dá)MCF7及MBAMB231細(xì)胞相比表達(dá)空載體乳腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出更多的核固縮及碎裂