過表達RIP3增強乳腺癌細胞對小白菊內(nèi)酯的敏感性的作用機制研究.pdf

1、分類號：R73057密級：學位類別：科學學位團專業(yè)學位口◇學校代碼：10062學號：2011602486學科門類：醫(yī)學又坪簣科鼻辱TlAlIJl麓■EDlCALU麓IV蠢曬nN碩士學位論文MASTER’SDISSERTIATION論文題目：過表達RIP3增強乳腺癌細胞對小白菊內(nèi)酯的敏感性的作用機制研究TITLEOverexpressionofRIP3sensitizeshumanbreastcancercellstoparthenoli

2、de—inducedapoptosis一級學科：臨床醫(yī)學二級學科：腫瘤學論文作者：路燦指導教師：佟仲生教授天津醫(yī)科大學研究生院二。一四年五月天津醫(yī)科大學碩士學位論文中文摘要目的：構建含有RIP3基因的真核表達載體，研究過表達RIP3基因對小白菊內(nèi)酯抗乳腺癌細胞作用的影響及機制。為其作為抗乳腺癌新藥的臨床應用提供理論基礎。方法：反轉錄聚合酶鏈反應(RTPCR)檢測及比較4株人乳腺癌細胞系MCF7，MDAMB231，MDAMB435，T47

3、D及正常人乳腺上皮細胞MCFl0A中RIP3mRNA的表達水平。以正常人乳腺上皮細胞MCFl0A反轉錄cDNA為模板，PCR擴增RIP3基因cDNA全長，將合成的RIP3基因克隆入mCherry載體的N末端，構建重組質(zhì)粒mCherryRIP3，測序證實mCherryRIP3重組質(zhì)粒構建正確與否。通過慢病毒法構建穩(wěn)定過表達RIP3的MCF7及MDAMB23l乳腺癌細胞株。熒光顯微鏡下觀察mCherryRIP3蛋白在MCF7及MDAMB23

4、1細胞內(nèi)的表達效率及定位。RTPCR及WesternBlot檢測目的基因RIP3在MCF一7及MDAMB23l細胞內(nèi)mRNA及蛋白質(zhì)的表達水平。用不同濃度小白菊內(nèi)酯分別處理過表達RIP3及表達空載體乳腺癌細胞，顯微鏡下觀察不同處理組乳腺癌細胞形態(tài)的變化，熒光顯微鏡下觀察不同處理組乳腺癌細胞核形態(tài)的改變，MTT比色法檢測不同處理組乳腺癌細胞增殖的變化及量效關系，流式細胞術檢測細胞凋亡及細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，WesternBlot檢測

5、PARP蛋白及其裂解片段表達水平，小白菊內(nèi)酯處理細胞的同時加用抗氧化劑NAC(N乙酰半胱氨酸，N—acetyl—Lcysteine)，MTT法檢測乳腺癌細胞增殖的變化。結果：1RTPCR檢測到MCF一7，MDAMB231，MDlA—MB435，T47D細胞中砌P3基因普遍低表達，但在正常乳腺癌細胞MCFl0A中高表達。2重組載體測序鑒定該序列與GenBank中的序列相同。獲得外源性RIP3穩(wěn)定轉染的乳腺癌MCF7及MDAMB231細胞株

6、，熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光蛋白表達率達90％以上，并且定位于胞質(zhì)。RTPCR及WesternBlot檢測到目的基因RIP3在轉染細胞中為過表達。3隨著小白菊內(nèi)酯濃度的增加，MCF7及MBAMB231細胞逐漸縮小變圓，細胞膜邊界不清、胞膜破裂、細胞溶解死亡，與表達空載體MCF7及MBA—MB一23l細胞相比過表達RIP3細胞出現(xiàn)上述形態(tài)變化較明顯。另外，過表達MCF7及MBAMB231細胞相比表達空載體乳腺癌細胞表現(xiàn)出更多的核固縮及碎裂