AG490增強(qiáng)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞對(duì)曲妥珠單抗敏感性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　研究表明，HER2信號(hào)通路中任一環(huán)節(jié)發(fā)生改變，都可能導(dǎo)致曲妥珠單抗治療抵抗。目前已發(fā)現(xiàn)的抵抗機(jī)制包括:HER家族受體與胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insu-lin-like growth factor1 receptor，IGF-1R)信號(hào)增加;HER2截短突變體p95-HER2的累積;PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的異?；罨?。除了這些可能導(dǎo)致HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞對(duì)曲妥珠單抗治療抵抗的機(jī)制外，JAK/STAT通路的激

2、活也可能是引起抵抗的另一重要機(jī)制，但目前相關(guān)報(bào)道很少。
　　JAK是一類非受體型酪氨酸激酶，該家族包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2四個(gè)成員。JAK激活后可以磷酸化STAT而使后者活化，從而構(gòu)成JAK/STAT信號(hào)通路。JAK/STAT信號(hào)通路在多種腫瘤組織中均存在過(guò)度激活的現(xiàn)象。在乳腺癌組織中，總的STAT3與磷酸化STAT3的表達(dá)水平均顯著高于正常乳腺組織，且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移程度密切相關(guān)。但STAT3的激活是否與乳腺癌

3、細(xì)胞對(duì)曲妥珠單抗的治療抵抗有關(guān)目前尚未見報(bào)道。因此，本研究擬首先以HER2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察曲妥珠單抗處理過(guò)程中STAT3的激活情況，并利用基因沉默技術(shù)及特異性抑制劑聯(lián)合曲妥珠單抗處理來(lái)觀察細(xì)胞的反應(yīng)，從而判斷STAT3的激活在乳腺癌細(xì)胞耐受曲妥珠單抗中的作用，以期為進(jìn)一步的臨床治療提供理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。
　　AG490是目前研究中常用的一種JAK/STAT通路特異性抑制劑。AG490可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合酪氨酸激酶JAK

4、2，從而抑制其活性。AG490抑制JAK的激活后，導(dǎo)致STAT3磷酸化被抑制，造成STAT3不能人核與相關(guān)DNA元件結(jié)合，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。當(dāng)前，AG490已成為臨床治療多種腫瘤的抗癌藥物，但AG490能否增敏曲妥珠單抗尚不清楚。
　　另外，由于激活的STAT3能上調(diào)抗凋亡基因Bcl-xL、Bcl-2與Mcl-1的表達(dá)，激活促血管生成生長(zhǎng)因子VEGF的表達(dá)，還能上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclinsD1/D2以及促細(xì)胞增殖蛋白c

5、-myc與Survivin的表達(dá)，并且有下調(diào)促凋亡基因p53表達(dá)的作用。尤其最近研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因SARI也可能參與了JAK/STAT信號(hào)介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生。SARI又稱為BATF2，在正常人組織中表達(dá)水平較高，而在相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平降低。外源性表達(dá)SARI可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，而過(guò)表達(dá)SARI卻對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯的增殖抑制效應(yīng)。但SARI抗癌的分子機(jī)制還沒完全清楚，特別是調(diào)控SARI表達(dá)的上游信號(hào)還不清楚。AG490作用后是否可通過(guò)

6、激活SARI來(lái)殺傷乳腺癌細(xì)胞也值得進(jìn)一步探討。
　　方法：
　　通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同濃度的曲妥珠單抗對(duì)HER2陽(yáng)性細(xì)胞SK-BR3增殖的抑制作用，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同濃度的曲妥珠單抗對(duì)HER2陽(yáng)性細(xì)胞SK-BR3死亡的影響，通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同濃度的曲妥珠單抗對(duì)HER2陽(yáng)性細(xì)胞SK-BR3克隆形成能力的影響，通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)曲妥珠單抗作用后SK-BR3細(xì)胞中STAT3的激活情況，然后通過(guò)siRNA沉默SK

7、-BR3細(xì)胞中的STAT3，免疫印跡實(shí)驗(yàn)確定沉默效果，然后通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)和臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)觀察沉默STAT3后曲妥珠單抗對(duì)SK-BR3細(xì)胞增殖與死亡的影響。再進(jìn)一步使用STAT3抑制劑AG490單獨(dú)或與曲妥珠單抗聯(lián)合處理SK-BR3細(xì)胞，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)和臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)觀察不同處理對(duì)細(xì)胞增殖與死亡的影響。然后采用相同的策略，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同濃度的AG490分別對(duì)HER2陽(yáng)性與HER2陰性細(xì)胞增殖的抑制作用，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)測(cè)定不

8、同濃度的AG490分別對(duì)HER2陽(yáng)性與HER2陰性細(xì)胞死亡的影響，通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同濃度的AG490分別對(duì)HER2陽(yáng)性與HER2陰性細(xì)胞克隆形成能力的影響，通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AG490作用后細(xì)胞中SARI的激活情況，然后通過(guò)siRNA沉默細(xì)胞中的SARI，免疫印跡實(shí)驗(yàn)確定沉默效果，然后通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)和臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)觀察沉默SARI后AG490對(duì)細(xì)胞增殖與死亡的影響。通過(guò)生物信息方法預(yù)測(cè)SARI基因啟動(dòng)子區(qū)中存在的STAT3結(jié)合位

9、點(diǎn)，并采用PCR方法從乳腺癌細(xì)胞中擴(kuò)增SARI基因的啟動(dòng)子區(qū)，并針對(duì)性的擴(kuò)增包含或不包含STAT3結(jié)合位點(diǎn)的片段，將各片段插入報(bào)告基因載體pGL3中，然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察AG490處理前后熒光素酶活性變化情況，從而確定AG490是否能夠通過(guò)上調(diào)SARI的轉(zhuǎn)錄來(lái)增強(qiáng)其表達(dá)并抗癌。
　　結(jié)果：
　　曲妥珠單抗能以劑量依賴的方式抑制SK-BR3細(xì)胞的增殖，0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml曲妥珠單抗的細(xì)胞相對(duì)增殖率

10、分別為76.22％、72.97％、61.08％、42.16％和23.78％。曲妥珠單抗也能以劑量依賴的方式促進(jìn)SK-BR3細(xì)胞死亡，0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml曲妥珠單抗相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞死亡率分別為:10.35±1.66％、18.37±2.49％、31.97±3.08％、46.78±5.67％、63.77±7.81％。與對(duì)照組相比，曲妥珠單抗還能以劑量依賴的方式抑制SK-BR3細(xì)胞的克隆形成，0.25、0.5、1.0

11、、2.0、4.0 mg/ml曲妥珠單抗相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞克隆形成率分別為:64.79±8.38％、35.21±13.29％、26.03±10.79％、16.29±10.34％、6.18±6.06％。曲妥珠單抗還可以濃度依賴性地激活SK-BR3細(xì)胞中的STAT3信號(hào)通路，體現(xiàn)為磷酸化STAT3水平顯著升高。用特異性siRNA沉默SK-BR3細(xì)胞中的STAT3后，CCK-8實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)可以顯著增強(qiáng)曲妥珠單抗對(duì)SK-BR3細(xì)胞的增殖抑制率，臺(tái)盼藍(lán)實(shí)

12、驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)可以顯著增加曲妥珠單抗對(duì)SK-BR3細(xì)胞的死亡率。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與AG490單獨(dú)處理組或曲妥珠單抗單獨(dú)處理組相比，AG490聯(lián)合曲妥珠單抗可以顯著增加SK-BR3細(xì)胞的增殖抑制率;臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，與AG490單獨(dú)處理組或曲妥珠單抗單獨(dú)處理組相比，AG490聯(lián)合曲妥珠單抗可以顯著增加SK-BR3細(xì)胞的死亡率。本研究結(jié)果進(jìn)一步證明，抑制STAT3信號(hào)通路確實(shí)可以增加曲妥珠單抗對(duì)SK-BR3細(xì)胞的殺傷率。
　　

13、AG490能以劑量依賴的方式抑制SK-BR3細(xì)胞與MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，AG490在兩種細(xì)胞中的IC50值分別為43.281μM與28.327μM。AG490也能以劑量依賴的方式促進(jìn)SK-BR3細(xì)胞與MDA-MB-231細(xì)胞死亡，SK-BR3細(xì)胞的對(duì)照組死亡率為1.02±0.24％，AG490處理組按照濃度梯度升高(25、50、100μM)關(guān)系相對(duì)應(yīng)的死亡率分別為:5.78±1.67％、16.89±2.67％、31.08±4.

14、65％;而在MDA-MB-231細(xì)胞，對(duì)照組死亡率為1.77±0.66％，AG490處理組按照濃度梯度升高(25、50、100μM)關(guān)系相對(duì)應(yīng)的死亡率分別為:8.05±2.05％、27.26±2.89％、44.18±4.98％。與對(duì)照組相比，AG490還能以劑量依賴的方式抑制SK-BR3細(xì)胞與MDA-MB-231細(xì)胞的克隆形成。在SK-BR3細(xì)胞，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組（依濃度升高）的細(xì)胞克隆數(shù)分別為:559±52、361±38、206±29、

15、117±15個(gè);在MDA-MB-231細(xì)胞，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組（依濃度升高）的細(xì)胞克隆數(shù)分別為:389±42、211±23、149±17、68±13個(gè)。定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨AG490處理濃度的升高，SK-BR3與MDA-MB-231細(xì)胞中SARI的mRNA水平均顯著升高;Western blot分析也進(jìn)一步證實(shí)，AG490可以劑量依賴的方式增強(qiáng)SK-BR3與MDA-MB-231細(xì)胞中SARI蛋白的表達(dá)水平。沉默SARI后AG490對(duì)MDA

16、-MB-231細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)降低。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在位于-1787到-1797位置存在1個(gè)經(jīng)典的STAT3結(jié)合位點(diǎn)。將包含SARI啟動(dòng)子區(qū)不同大小的兩個(gè)片段(-1到-2000bp，-1到-1700bp)分別克隆到報(bào)告質(zhì)粒pGL3-basic中，并與對(duì)照質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不含STAT3結(jié)合位點(diǎn)的-1到-1700bp片段在AG490處理前后熒光素酶活性無(wú)明顯改變，而包含該結(jié)合位點(diǎn)的-

17、1到-2000bp片段則在AG490處理后熒光素酶活性顯著增高。這一結(jié)果說(shuō)明AG490作用后可通過(guò)增加SARI啟動(dòng)子活性而增強(qiáng)SARI的轉(zhuǎn)錄來(lái)提高其表達(dá)，這一過(guò)程可能與AG490對(duì)STAT3的抑制及STAT3對(duì)SARI啟動(dòng)子活性的抑制相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.曲妥珠單抗可以劑量依賴性地抑制HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其死亡、并抑制其細(xì)胞克隆的形成。
　　2.曲妥珠單抗處理導(dǎo)致HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中STAT3的

18、激活，沉默STAT3或抑制STAT3的活性均能增強(qiáng)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞對(duì)曲妥珠單抗的敏感性。
　　3.AG490可以劑量依賴性地分別抑制HER2陽(yáng)性與HER2陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其死亡、并抑制其細(xì)胞克隆的形成。
　　4.AG490處理導(dǎo)致HER2陽(yáng)性與HER2陰性乳腺癌細(xì)胞中SARI表達(dá)上調(diào)，沉默SARI后能降低乳腺癌細(xì)胞對(duì)AG490的敏感性。
　　5.SARI基因的啟動(dòng)子區(qū)存在STAT3的結(jié)合位點(diǎn)，不含該結(jié)合