4-HPR聯(lián)合應(yīng)用小白菊內(nèi)酯對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡(apoptosis)，又稱程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)，是由于細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化或死亡信號(hào)觸發(fā)以及在基因調(diào)控下所引起的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程。目前已證實(shí)多種基因參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控。研究表明，無(wú)論是體外的組織細(xì)胞培養(yǎng)還是體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞凋亡存在于肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中?，F(xiàn)在肝癌的許多非手術(shù)性治療方法，如經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈栓塞化療術(shù)(T

2、ACE)、經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)酒精注射術(shù)(PEI)、射頻、微波固化(PMCT)、冷凍等都與肝癌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。因此，通過(guò)誘導(dǎo)促凋亡基因表達(dá)，可達(dá)到治療目的。
　　4-羥基維胺酯(N-4-hydroxyphenyl retinoid，4-HPR)是一種類視黃醇的合成化合物，能抑制腫瘤的發(fā)展，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，但其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，尚不清楚。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄激活因子，與腫瘤細(xì)胞的耐藥性和抗凋亡作用密切相關(guān)。芳香植物小白菊(Ta

3、nacetumparthenium)以及它的主要生物活性成分－小白菊內(nèi)酯(Parthenolide)，具有抗菌和抗炎作用，并可抑制NF-κB的激活。盡管上述兩種藥物作用機(jī)理方面的研究已涉及到腫瘤細(xì)胞分化，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及逆轉(zhuǎn)耐藥等方面，但是4-HPR聯(lián)合應(yīng)用小白菊內(nèi)酯對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡的作用及其分子機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)的目的是研究小白菊內(nèi)酯對(duì)4-HPR誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，檢測(cè)4-HPR誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的差異表達(dá)基因，篩選小

4、白菊內(nèi)酯引起的細(xì)胞凋亡相關(guān)基因候選者并探索其作用途徑，為今后肝癌的藥物治療提供依據(jù)。
　　本實(shí)驗(yàn)利用TUNEL法及流式細(xì)胞儀技術(shù)，采用Hep3B和SK-HEP-1兩種肝癌細(xì)胞株，觀察小白菊內(nèi)酯聯(lián)合應(yīng)用4-HPR對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的作用，并利用凝膠電泳遷移率變化分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)、抗體膠移位分析(supershift assay)和放射自顯影技術(shù)檢測(cè)NF-κB、NF

5、-κB p65、NF-κB p50、c-Rel、p52及RelB結(jié)合蛋白的表達(dá)；利用DD－PCR技術(shù)檢測(cè)4-HPR處理和未處理的Hep3B差異表達(dá)基因，進(jìn)一步確認(rèn)和篩選凋亡相關(guān)基因候選者，并對(duì)篩選的cDNA進(jìn)行克隆，測(cè)定基因序列后利用基因庫(kù)中的BLAST程序確認(rèn)；利用半定量反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Northern blotting技術(shù)，觀察4-HPR聯(lián)合應(yīng)用小白菊內(nèi)酯引起人肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中差異表達(dá)基因，并進(jìn)行分析。5’-

6、末端快速擴(kuò)增法(rapid amplification of cDNA ends，RACE)制備上調(diào)基因ANKRD1，并克隆到 pEGM-T載體，進(jìn)行鑒定；利用 PCR技術(shù)擴(kuò)增 ANKRD1基因的正(sense)反(antisense)方向基因，并通過(guò)基因重組技術(shù)連接到增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因融合表達(dá)載體pEGFPC3和 pcDNA3.1/HisA載體。再采

7、用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將重組基因轉(zhuǎn)入 Hep3B和SK-HEP-1兩種肝癌細(xì)胞株，同時(shí)在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)，對(duì)轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞用G418（表達(dá)載體帶有neo基因片斷，對(duì)G418具有抗藥性）篩選陽(yáng)性克隆并分析克隆集落形成。在熒光顯微鏡下標(biāo)記發(fā)光良好的單個(gè)克隆，分離克隆繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)建立穩(wěn)定表達(dá)ANKRD1基因的細(xì)胞系,同時(shí)利用Western blotting技術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)目的基因蛋白的表達(dá)。在激光共聚焦顯微鏡（laser

8、 scanning confocal microscopy，LSCM）下，采用免疫熒光細(xì)胞染色法對(duì)Hep3B、SK-HEP-1、HepG2和Huh7肝癌細(xì)胞進(jìn)行ANKRD1基因編碼蛋白的定位和表達(dá)，并觀察該基因高表達(dá)和低表達(dá)時(shí)細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化，并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)高表達(dá)ANKRD1基因的細(xì)胞凋亡率。
　　本研究的主要實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果：
　　1.TUNEL法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率：Hep3B和SK-HEP-1兩種肝癌細(xì)胞株，分別

9、給予4-HPR(10uM/ml)和4-HPR(10uM/ml)聯(lián)合應(yīng)用小白菊內(nèi)酯(4uM/ml)，72個(gè)小時(shí)后通過(guò) TUNEL染色檢測(cè)凋亡發(fā)生率，可見(jiàn)其凋亡率隨著藥物的不同升高，4-HPR聯(lián)合應(yīng)用小白菊內(nèi)酯的細(xì)胞凋亡率近2倍高于單用4-HPR組，P<0.01。通過(guò)流式細(xì)胞儀可觀察小白菊內(nèi)酯增強(qiáng)4-HPR誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，M1期細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組和4-HPR組，P<0.01，但不影響細(xì)胞周期阻滯。
　　2.利用 EMSA方法

10、檢測(cè)藥物處理后不同時(shí)間 NF-κB的表達(dá)：4-HPR處理Hep3B和SK-HEP-1細(xì)胞0.2，0.5，1，3，6，12及24h后測(cè)定NF-κB表達(dá)，結(jié)果NF-κB隨4-HPR作用時(shí)間延長(zhǎng)增高。12h時(shí)NF-κB的活性最強(qiáng)。利用NF-κB家族特定抗體進(jìn)行Supershiftassay結(jié)果顯示以NF-κB p65在4-HPR處理的Hep3B細(xì)胞中高表達(dá)，之后觀察4-HPR(10uM/ml)聯(lián)合應(yīng)用小白菊內(nèi)酯(4uM/ml)對(duì)不同時(shí)間Hep

11、3B肝癌細(xì)胞NF-κB的影響，結(jié)果小白菊內(nèi)酯有效地阻斷了4-HPR誘導(dǎo)的NF-κB活性，且12h時(shí)最明顯。
　　3.利用DD-PCR法檢測(cè)4-HPR誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中基因表達(dá)：提取4-HPR處理和4-HPR未處理的Hep3B細(xì)胞總RNA，利用DD-PCR技術(shù)對(duì)大約13000個(gè)不同cDNA片斷進(jìn)行對(duì)照分析，并篩選93個(gè)差異表達(dá)的cDNA，并克隆到TA載體，測(cè)定基因序列后利用基因庫(kù)中的BLAST程序確認(rèn)。
　　4.利用North

12、ern blotting和RT-PCR進(jìn)一步檢測(cè)小白菊內(nèi)酯調(diào)控的凋亡相關(guān)基因：對(duì)DD-PCR檢測(cè)出的差異表達(dá)基因，通過(guò)Northern blot和RT-PCR技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)4-HPR聯(lián)合應(yīng)用小白菊內(nèi)酯時(shí)差異表達(dá)基因，結(jié)果篩選了35個(gè)差異表達(dá)基因，由小白菊內(nèi)酯上調(diào)18個(gè)基因(SNTB1，ALB，PSMD2，RPS23，DNMT，GADD153，SERPIND1，ARPP-19，ND2，ANKRD1和2個(gè)未知基因與對(duì)照組相比高表達(dá)1.5倍)

13、和17個(gè)下調(diào)基因(Gas5，TF，ND3，CYR61，KTN1和5個(gè)未知基因與對(duì)照組相比低表達(dá)50％)，其中GADD153，NACA，TF和CYR61已證明與NF-κB活性有關(guān)。
　　5.克隆基因及確定基因：35個(gè)凋亡相關(guān)基因，其中一個(gè)上調(diào)基因HA1A2從肝cDNA中分離克隆測(cè)序，結(jié)果與Gene Bank中ANKRD1一致，此基因在心肌也稱為是CARP基因。
　　6.構(gòu)建ANKRD1正(sense，S)反(antisense

14、，AS)方向真核表達(dá)載體及在Hep3B和SK-HEP-1細(xì)胞內(nèi)表達(dá)：成功克隆了ANKRD1全長(zhǎng)基因，并利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增ANKRD1 sense和antisense基因片斷，與pEGFPC3和pcDNA3.1/HisA真核表達(dá)載體進(jìn)行重組，成功構(gòu)建了 ANKRD1真核表達(dá)載體，且在 Hep3B和SK-HEP-1細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)，并通過(guò)Western blotting和熒光顯微鏡進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　7.細(xì)胞集落形成：將已構(gòu)建的真核表

15、達(dá)載體轉(zhuǎn)染到 Hep3B和 SK-HEP-1細(xì)胞，用 G418篩選陽(yáng)性克隆時(shí)，觀察到轉(zhuǎn)染 ANKRD1(S)的細(xì)胞克隆集落形成的細(xì)胞融合灶與 pEGFPC3和pcDNA3.1/HisA空載體和ANKRD1(AS)相比減少約50%。
　　8. ANKRD1蛋白的定位及細(xì)胞形態(tài)改變：將末端標(biāo)記有綠色熒光蛋白（GFP）的ANKRD1瞬間轉(zhuǎn)染到Hep3B(S),Hep3B(AS)和SK-HEP-1，HepG2,Huh7細(xì)胞并利用鼠的抗AN

16、KRD1的單克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，GFP融合ANKRD1蛋白主要在胞漿內(nèi)表達(dá)，在細(xì)胞核內(nèi)很少表達(dá)；高表達(dá)細(xì)胞核膜濃縮、碎片狀，引起細(xì)胞凋亡；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFPC3-ANKRD1基因的Hep3B細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，空載體pEGFPC3轉(zhuǎn)染細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率相比未發(fā)生明顯改變，但轉(zhuǎn)染pEGFPC3-ANKRD1細(xì)胞凋亡率與空載體pEGFPC3轉(zhuǎn)染細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比有明顯增高，增高至27.5±2.5%。

17、
　　以上結(jié)果提示：
　　1.單獨(dú)應(yīng)用小白菊內(nèi)酯不引起肝癌細(xì)胞凋亡，但與4-HPR聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞凋亡，并且與細(xì)胞周期阻滯無(wú)關(guān)。
　　2.小白菊內(nèi)酯增強(qiáng)4-HPR誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡作用與抑制NF-κB活性有關(guān)。
　　3.增加藥物引起的細(xì)胞凋亡過(guò)程中，篩選出肝癌凋亡相關(guān)基因35個(gè)，其中一個(gè)上調(diào)基因HA1A2從肝cDNA中分離克隆并證明與ANKRD1一致。
　　4.成功克隆ANKRD1基因，并構(gòu)建了ANK