過表達(dá)線粒體融合素基因-2增強(qiáng)人乳腺癌T47D細(xì)胞光動(dòng)力治療敏感性的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:探討過表達(dá)線粒體融合素基因-2（mitofusin-2，Mfn-2）對(duì)人乳腺癌T47D細(xì)胞光動(dòng)力治療敏感性的影響及其可能機(jī)制，探尋光動(dòng)力治療的潛在靶點(diǎn)，為臨床應(yīng)用光動(dòng)力治療乳腺癌提供理論依據(jù)。
　　 方法:Real-time PCR檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞系Mfn-2的mRNA表達(dá)情況;Westernblotting檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞系Mfn-2蛋白表達(dá);脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染pEGFP和pEGFP-Mfn-2質(zhì)粒至T47D細(xì)胞;Rea

2、l-time PCR和Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。應(yīng)用不同劑量光敏劑亞甲藍(lán)處理T47D細(xì)胞，630nm波長半導(dǎo)體激光治療儀照射，MTT比色法檢測(cè)光動(dòng)力療法聯(lián)合轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn-2對(duì)人乳腺癌T47D細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量T47D細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位變化，熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位變化。激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn-2聯(lián)合光動(dòng)力治療對(duì)線粒體超微形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。
　　 結(jié)果:
　　

3、 1.Real-time PCR結(jié)果顯示:與正常乳腺細(xì)胞相比，Mfn-2 mRNA在HCC38細(xì)胞系中高表達(dá)[(1±0.05) vs(8.82±0.26)，P＜0.01]，而在T47D、MDA-MB-231、MCF-7及MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞系中均低表達(dá)[(1±0.05)vs(0.50±0.06),(0.15±0.01),(0.93±0.08),(0.14±0.01),(0.06±0.01),P＜0.05]。
　　 2

4、.Western-blotting結(jié)果顯示:與正常乳腺細(xì)胞相比，Mfn-2 mRNA在HCC38細(xì)胞系中高表達(dá)，而在T47D、MDA-MB-231、MCF-7及MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞系中均低表達(dá)。
　　 3.轉(zhuǎn)染EGFP-Mfn-2至T47D細(xì)胞48h后，Real-time PCR和Western-blotting結(jié)果顯示T47D細(xì)胞系可以高表達(dá)Mfn-2 mRNA和蛋白[(0.48±0.07) vs(0.50±0.06

5、),(946±41.72)，P＜0.05]。
　　 4.轉(zhuǎn)染48h行PDT治療后倒置顯微鏡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，pEGFP組T47D細(xì)胞呈貼壁生長，增殖速度快，細(xì)胞飽滿、胞膜完整、邊界清晰;pEGFP-Mfn-2組和pEGFP+PDT組T47D細(xì)胞細(xì)胞邊界變圓，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡、細(xì)胞膜邊界不清;pEGFP-Mfn-2+PDT治療組細(xì)胞脫落，胞膜破裂、細(xì)胞溶解死亡。
　　 5.MTT分析結(jié)果顯示， pEGFP-Mfn-2轉(zhuǎn)染可明顯

6、提高T47D細(xì)胞對(duì)光動(dòng)力治療的敏感性，[5μm/ml亞甲藍(lán)，pEGFP-Mfn-2+PDT組(46.50±1.72)％vs pEGFP+PDT組(59.96±1.21)％,P＜0.05]。
　　 6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:與pEGFP+PDT組相比，pEGFP-Mfn-2+PDT組細(xì)胞凋亡率明顯升高[5μm/ml亞甲藍(lán)，pEGFP-Mfn-2+PDT組(81.2±2.1)％vs pEGFP+PDT組（68.8±2.6）％，P＜

7、0.05]。
　　 7.熒光顯微鏡顯示:pEGFP組細(xì)胞狀態(tài)良好，線粒體熒光探針定位于胞漿內(nèi)，顯示為紅色熒光，胞漿著色深;轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn-2組部分細(xì)胞胞漿熒光強(qiáng)度較pEGFP組稍弱;pEGFP+PDT組大部分細(xì)胞熒光強(qiáng)度減弱;pEGFP-Mfn-2+PDT組:大部分細(xì)胞脫落，偶見部分未脫落細(xì)胞，細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯減弱。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:pEGFP-Mfn-2轉(zhuǎn)染聯(lián)合PDT組線粒體膜電位明顯降低[5μm/ml亞甲藍(lán)，p

8、EGFP-Mfn-2+PDT組(23.3±1.8)％vspEGFP+PDT組（1.3±0.1）％，P＜0.05]。
　　 8.激光共聚焦顯微鏡顯示:pEGFP-Mfn-2組和pEGFP+PDT組可導(dǎo)致線粒體融合，而pEGFP-Mfn-2+PDT組可導(dǎo)致線粒體崩解，完全失去其形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)論:
　　 1.與正常乳腺細(xì)胞相比， Mfn-2在人乳腺癌T47D、MDA-MB-231、MCF-7及MDA-MB-435