糖基化終末產(chǎn)物對大鼠腎臟微血管內(nèi)皮細胞的損傷及丙丁酚的保護作用.pdf

1、糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)作為糖尿病的特征性并發(fā)癥是終末期腎衰常見原因之一。糖尿病腎病主要是微血管病變，其機制可能與糖基化終末產(chǎn)物(advanced glyciation end products，AGEs)誘導(dǎo)的腎臟微血管內(nèi)皮細胞損傷有關(guān)。AGEs是機體長期高血糖狀態(tài)下體內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基與醛基之間發(fā)生的非酶性糖基化反應(yīng)的終產(chǎn)物的總稱。糖尿病腎病微血管病變時，循環(huán)中AGEs與受體結(jié)合誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并影響內(nèi)皮

2、細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。丙丁酚(Probucol，普羅布考)，化學(xué)名：4，4-[(1.甲基亞乙基)雙(硫)]雙[2,6-雙(1，1-二甲基乙基)苯酚]。20世紀70年代就作為一種降脂藥物應(yīng)用于臨床，最近的研究發(fā)現(xiàn)它不僅具有調(diào)血脂、抗氧化、抗炎、改善內(nèi)皮細胞功能、抑制血管內(nèi)膜增生等作用，在防治心血管疾病和延緩糖尿病腎病發(fā)展和改善腎功能等方面有廣闊的應(yīng)用前景。 本實驗通過建立糖尿病腎病的體外模型探討AGEs導(dǎo)致大鼠腎臟微血管內(nèi)皮細胞的損傷的

3、機制，以及抗氧化劑丙丁酚的保護作用的分子機制。 方法： 體外分離培養(yǎng)大鼠腎臟微血管(RMEC)內(nèi)皮細胞，將其分為正常對照組、AGE-BSA損傷組，丙丁酚干預(yù)組；應(yīng)用TBA法、硝酸還原酶法檢測各組細胞丙二醛(MDA)和NO濃度；采用RT-PCR法及Western-blot檢測細胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA水平和還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶蛋白表達；應(yīng)用熒光顯微鏡觀察核轉(zhuǎn)錄因子-k B(NF-K B)活化。

4、 結(jié)果： 與正常對照組相比，損傷組內(nèi)皮細胞MDA濃度上升(p<0.05或p<0.01)、eNOS mRNA水平降低、細胞質(zhì)NADPH氧化酶蛋白表達減少。AGE-BSA作用時間在30min和6h時培養(yǎng)液中NO濃度升高(p<0.05或p<0.01)，而12h后NO濃度隨著AGEs作用時間延長降低(p<0.05或p<0.01)。丙丁酚濃度在(10、20、50、100μmol/L)范圍內(nèi)以劑量依賴方式降低細胞MDA水平(p<0.0

5、5或p<0.01)，抑制NADPH氧化酶蛋白活化，上調(diào)NO和eNOS mRNA水平。AGE-BSA刺激微血管內(nèi)皮細胞后NF-kB表達部位由細胞質(zhì)移到核內(nèi)，作用30min時核內(nèi)表達達高峰，而后持續(xù)高表達。 討論： 本實驗中我們觀察到從腎皮質(zhì)分離并體培養(yǎng)細胞呈典型的鋪路石外觀，Ⅷ因子相關(guān)抗原陽性和Matrigel上形成管腔樣結(jié)構(gòu)，根據(jù)這些特征鑒定其為內(nèi)皮細胞。多項研究表明氧化應(yīng)激在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病過程中具有重要作用循環(huán)

6、中AGEs水平的增加是導(dǎo)致活性氧增加的直接原因。本實驗中觀察到AGEs能導(dǎo)致RMEC損傷和氧化應(yīng)激在RMEC損傷中具有重要作用。此外，為了進一步研究氧化應(yīng)激發(fā)生的機制，本實驗分別檢測了兩種與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的基因NADPH氧化酶和eNOS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AGEs能導(dǎo)致NADPH氧化酶蛋白表達增加和eNOSmRNA水平異常以及抗氧化劑丙丁酚干預(yù)能夠抑制AGEs能導(dǎo)致NADPH氧化酶蛋白表達增加和eNOSmRNA水平。NF-kB是一種重要轉(zhuǎn)錄因子

7、，廣泛參與了炎癥、增殖等病理過程。本實驗中發(fā)現(xiàn)，AGE-BSA作用于RMEC后，NF-kB從細胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移至細胞核，從而驗證了AGE能夠激活NF-kB這一重要通路；probucol抗炎作用的機制可能與其抑制NF-kB的活化作用有關(guān)。 結(jié)論： 1.糖基化終末產(chǎn)物導(dǎo)致的大鼠RMEC損傷和功能下降的機制可能包括①引發(fā)脂質(zhì)過氧化；②活化NADPH氧化酶，增加活性氧的生成；③eNOSmRNA水平異常，影響NO生成；④激活NF-kB。