Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶HATL4的表達及其單克隆抗體的研制.pdf

1、目的：II型跨膜絲氨酸蛋白酶（Type II Transmembrane Serine Proteases，TTSPs）是一類通過氨基末端跨膜區(qū)域錨定在細胞膜上的絲氨酸蛋白酶，在哺乳動物的許多生物學過程中扮演著重要角色，其功能異?？蓪е掳┌Y、缺鐵性貧血、耳聾、心血管疾病等。在人類，TTSPs共有17個成員，其中人呼吸道胰蛋白酶樣蛋白酶（Human airway trypsin-like protease，HAT）最早發(fā)現(xiàn)存在于慢性呼吸道

2、疾病患者的痰液中，在粘液生成、水解流感病毒的血凝素抗原以及細胞遷移和基底膜的降解中起到關(guān)鍵性的作用。HATL4蛋白酶為TTSPs中HAT/DESC亞家族中的一個成員，目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)HATL4蛋白酶生物學功能的任何報道，對它的生物學活性和功能知之甚少。本研究首先探討HATL4在人惡性血液病細胞系和白血病患者骨髓細胞中的表達；然后表達、純化重組HATL4，免疫小鼠，研制抗人HATL4單克隆抗體；并運用蛋白質(zhì)免疫印跡法、流式細胞術(shù)等實驗

3、方法對所制備的抗體進行驗證，為進一步研究HATL4的生物學功能提供工具。
　　方法：
　?。?）利用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)檢測HATL4在人惡性血液病細胞系和白血病患者骨髓細胞中的表達；
　?。?）利用RT-PCR從人成巨核細胞白血病細胞系MEG-01中擴增編碼HATL4蛋白的蛋白酶活性區(qū)域片段，與克隆載體pMD18-T simple連接，經(jīng)Sac I、Hind III雙酶切鑒定后送測序，然后定向插入原核表達

4、載體pQE30，并在原核表達菌株M15中實現(xiàn)重組蛋白6?His-HATL4的表達；
　?。?）利用鎳離子親和層析法純化融合蛋白，并對純化產(chǎn)物復性和濃縮；用Western blotting分析純化產(chǎn)物；
　　（4）以純化的HATL4融合蛋白作為免疫原免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴細胞雜交技術(shù)，將免疫小鼠的脾臟細胞與同種系小鼠的骨髓瘤細胞SP2/0進行融合。采用ELISA方法，用純化的重組HATL4融合蛋白篩選只與HATL4反

5、應的能持續(xù)分泌抗人 HATL4單克隆抗體的雜交瘤細胞株。通過 Protein-G親和層析柱純化腹水， SDS-PAGE分析純化結(jié)果。
　　（5）HATL4真核表達載體的構(gòu)建：采用RT-PCR技術(shù)從人成巨核細胞白血病細胞系（MEG-01）中擴增HATL4基因cDNA全長基因片段，經(jīng)過酶切鑒定后，克隆至pcDNATM3.1/V5-HisTOPO TA載體，測序鑒定。
　?。?）HATL4在CHO細胞的表達：根據(jù)Fermentas

6、轉(zhuǎn)染試劑說明書，將HATL4真核表達載體轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵巢細胞（CHO），用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測重組蛋白的表達。
　?。?）HATL4抗體的鑒定：流式細胞術(shù)及免疫熒光等實驗方法對所制備的抗體進行鑒定。
　　結(jié)果：
　?。?）采用RT-PCR技術(shù)對18種人惡性血液病細胞系和81例惡性血液病患者骨髓細胞中HATL4 mRNA的表達進行分析，發(fā)現(xiàn)HATL4 mRNA在急性髓細胞白血病（Acute Myelocytic Leu

7、kemia，AML）患者骨髓細胞中表達特異性增高。
　?。?）構(gòu)建了 HATL4原核表達質(zhì)粒，并在 M15中成功表達 HATL4融合蛋白；SDS-PAGE顯示該融合蛋白分子量約26 kDa，與預期結(jié)果相符；融合蛋白以包涵體形式存在，表達產(chǎn)量約占菌體總蛋白60%；經(jīng)純化、復性后的融合蛋白純度>95%，Western blotting結(jié)果顯示一條his抗體特異性識別的蛋白條帶。
　?。?）成功獲得分泌穩(wěn)定的單克隆抗體雜交瘤細胞株

8、5株，分別命名為2E6、2D7、2H10、3C10、6D3。經(jīng)過Protein-G親和層析柱純化后的5株單克隆抗體分別在還原劑與非還原劑條件下進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色。非還原條件下可見一條150 kDa的條帶，還原條件下可見分子量55 kDa的重鏈和25 kDa的輕鏈。
　?。?）成功構(gòu)建含有HATL4全長cDNA的真核表達載體。轉(zhuǎn)染CHO細胞，Western blot結(jié)果顯示，V5抗體能檢測到轉(zhuǎn)染后細胞裂解液中的約5

9、0 kDa的HATL4蛋白條帶。
　?。?）流式細胞術(shù)檢測表明5株單抗均能特異性識別 CHO細胞中表達的重組HATL4。在白血病細胞株中，也檢測到HATL4在MEG-01中表達率高達85.7%，在K562及KU-812中表達較弱，分別為4.7%和19.7%，而在NB4中幾乎沒有表達，只有1.23%。免疫熒光發(fā)現(xiàn)我們研制的抗體能特異性識別HATL4，并發(fā)現(xiàn)HATL4定位于腫瘤細胞膜表面。
　　結(jié)論：本研究首次發(fā)現(xiàn)HATL4在急