Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶與惡性血液疾病的研究.pdf

1、目的:Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶(TypeⅡ Transmembrane Serine Proteases，TTSPs)是一類通過氨基末端跨膜區(qū)域錨定在細胞膜上的絲氨酸蛋白酶，在哺乳動物的許多生物學過程中扮演著重要角色，其功能異?？蓪е掳┌Y、缺鐵性貧血、耳聾、心血管疾病等。在人類，TTSPs共有17個成員，其中研究比較廣泛的matriptase在正常生理、病理及腫瘤中起著廣泛而重要的作用，但是它在惡性血液疾病如慢性淋巴細胞白血病(Chroni

2、c Lymphocytic Leukemia，CLL)中的生物學功能目前尚無相關報道。本研究旨在探討Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶在惡性血液疾病細胞中的表達。基于前期研究結果，我們以matriptase作為重點研究對象，深入探討matriptase在CLL中的作用及機制，為進一步研究Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶的功能以及它們在惡性血液疾病發(fā)生發(fā)展中的作用提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 (1)利用逆轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse tra

3、nscription PCR，RT-PCR)技術對人惡性血液病細胞系和惡性血液病患者骨髓細胞中17種TTSPs mRNA的表達進行分析;
　　 (2)實時定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測白血病患者骨髓細胞中 matriptase及其內源性特異性抑制劑肝細胞生長因子激活物抑制劑1(Hepatocyte growth factor activator inhibitor-1,HA

4、I-1)mRNA的表達;
　　 (3) Western blot檢測惡性血液病細胞系和白血病患者骨髓細胞中matriptase蛋白的表達;
　　 (4)流式細胞術和免疫熒光染色檢測Namalwa細胞系和CLL患者骨髓細胞中matriptase蛋白的表達及定位，以正常人外周血(Normal peripheral blood，NPB)白細胞作對照;
　　 (5)利用磷酸鈣沉淀法制備慢病毒，并轉導B細胞來源的淋巴瘤細胞

5、系Namalwa用于干擾matriptase mRNA的表達，qRT-PCR和Western blot技術檢測干擾效率;
　　 (6)基底膜侵襲實驗(Transwell Invasion Assay)檢測matriptase表達下調后及matriptase特異性抑制劑HAI-1作用后腫瘤細胞侵襲能力的改變;
　　 (7)細胞遷移實驗(Transwell Migration Assay)檢測HAI-1作用后腫瘤細胞遷移能力

6、的改變;
　　 (8)細胞增殖實驗(Cell Counting Kit-8，CCK-8)檢測HAI-1作用后腫瘤細胞增殖能力的影響。
　　 結果:
　　 (1)采用RT-PCR技術對15種人惡性血液病細胞系和81例惡性血液病患者骨髓細胞中17種TTSPs mRNA的表達進行分析，發(fā)現(xiàn)matriptase、HATL4、polyserase-1等TTSPs mRNA在某些惡性血液病細胞系或白血病患者骨髓細胞中特異性高

7、表達，如matriptase mRNA在B細胞來源的淋巴瘤細胞系(Namalwa和Raji)和CLL患者骨髓細胞中表達特異性增高，而在其它惡性血液病細胞系或白血病骨髓患者細胞中基本檢測不到表達;HATL4 mRNA在急性髓系白血病(AcuteMyelocytic Leukemia，AML)患者骨髓細胞中表達特異性增高，而在其它白血病患者骨髓細胞中基本檢測不到表達。我們以在慢性淋巴細胞白血病(CLL)中高表達的matriptase作為重點

8、研究對象，進一步探討其在CLL病程進展中的生物學功能及作用機制。
　　 (2) qRT-PCR技術定量地檢測了49例白血病患者骨髓細胞中matriptase和HAI-1 mRNA的表達。結果顯示matriptase mRNA在CLL患者骨髓細胞中高水平表達，表達量為正常人外周血(Normal Peripheral Blood，NPB)和正常人骨髓(Normal bone Marrow，NBM)細胞表達量的22倍以上，在其它類型白

9、血病患者如AML、急性淋巴細胞白血病(Acute Lymphocytic Leukemia，ALL)、慢性粒細胞性白血?。–hronic Myelocytic Leukemia，CML）中幾乎檢測不到;而HAI-1 mRNA在CLL中的表達量很低。
　　 (3)利用Westem blot檢測人惡性血液病細胞系和白血病患者骨髓細胞中matriptase蛋白的表達。結果顯示 matriptase在B細胞來源的淋巴瘤細胞系(Namal

10、wa和 Raji)和CLL患者骨髓細胞中表達明顯增加，而在其它細胞系或白血病患者骨髓細胞中檢測不到，與mRNA的表達結果一致。
　　 (4)流式細胞術結果表明matriptase在Namalwa細胞和CLL患者骨髓細胞中的陽性表達率分別為99％和93％，而在NPB細胞表面的表達為陰性(0.5％)。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，matriptase定位于Namalwa和CLL患者骨髓細胞的膜表面，且表達量明顯高于NPB。
　　 (5)

11、將含siM（包含特異性沉默matriptase的shRNA核苷酸序列）和siC（包含一段無義的對照shRNA核苷酸序列）穿梭質粒的病毒轉導Namalwa細胞，siM和siC病毒載體上含有綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)。培養(yǎng)72h后，流式分選得到GFP陽性率大于99％的細胞。通過qRT-PCR和Western blot技術檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組siC相比，在轉導siM病毒的Namalwa細胞中，ma

12、triptasemRNA和蛋白表達抑制率＞80％。這一結果表明，我們采用shRNA沉默matriptase表達的實驗是成功的，可用于后續(xù)相關的功能學研究。
　　 (6)基底膜侵襲實驗表明，Namalwa細胞的matriptase mRNA表達下調后，穿過基底膜Matrigel膠的細胞數(shù)量明顯減少;通過HAI-1抑制 matriptase蛋白活性后，Namalwa和Raji細胞降解基底膜Matrigel膠的能力均顯著降低;HAI-

13、1作用于CLL患者骨髓細胞后，與加入緩沖液對照(Buffer Ctrl)組相比，CLL細胞降解基底膜Matrigel膠的能力顯著降低，而加入胰蛋白酶抑制劑(Soybean TrypsinInhibitor，STI)組則沒有差異。這提示matriptase可能通過降解細胞外基底膜來增強細胞的侵襲性，參與CLL的發(fā)生發(fā)展過程，這一作用能被HAI-1所抑制。
　　 (7)腫瘤細胞遷移實驗表明，加入不同濃度HAI-1后，Namalwa、

14、Raji以及CLL患者骨髓細胞的遷移能力沒有明顯改變。
　　 (8)腫瘤細胞增殖實驗表明，加入不同濃度HAI-1后，Namalwa、Raji以及CLL患者骨髓細胞的增殖能力沒有明顯改變。
　　 結論:我們在國內外最先研究發(fā)現(xiàn)matriptase在CLL患者骨髓細胞中特異性高表達，提示matriptase可能成為CLL新的細胞膜生物標記。下調白血病細胞中matriptase的表達及用其特異性抑制劑HAI-1抑制matrip