皺紋盤鮑絲氨酸蛋白酶的基因克隆、體外表達及其免疫調(diào)控作用.pdf

1、鮑魚作為中國傳統(tǒng)名貴海產(chǎn)品，一直受到人們的喜愛。隨著我國經(jīng)濟快速增長以及人們生活水平的提高，鮑魚的需求量不斷增加，同時，也帶動了鮑魚養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展。但是，海水污染、高密度養(yǎng)殖等因素導(dǎo)致鮑魚疾病時常發(fā)生，造成巨大的經(jīng)濟損失。鮑魚病害的防治已成為鮑魚養(yǎng)殖業(yè)中亟待解決的問題，其中，副溶血弧菌一直是鮑魚養(yǎng)殖的主要病原。先天免疫是鮑魚抵抗病原侵襲的主要途徑。因此，深入探索參與鮑魚先天性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵基因和蛋白的功能對于解決鮑魚病害具有特別重要的

2、意義。
　　前期研究提示，絲氨酸蛋白酶在鮑魚先天免疫中扮演重要的角色。本研究根據(jù)其他軟體動物絲氨酸蛋白酶基因的保守序列設(shè)計特異性引物，采用巢式PCR和RACE技術(shù)從皺紋盤鮑的肝臟組織克隆獲得了絲氨酸蛋白酶(Haliotis discus hanai serine proteinase，Hdh-SP)基因cDNA全長序列，序列分析結(jié)果顯示Hdh-SP cDNA全長共1107 bp，包含5'UTR111 bp，3'UTR39 bp，O

3、RF957 bp，編碼319個氨基酸殘基。通過序列比對結(jié)果顯示，該氨基酸序列與太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)、櫛孔扇貝(Azumapecten farreri)、縊蟶(Sinonovaculaconstricta)和馬氏珠母貝(Pinctada fucata)中絲氨酸蛋白酶的同源性分別為54％、50％、47％和40％。Hdh-SP基因編碼蛋白的預(yù)測相對分子質(zhì)量為34.0 kDa，理論等電點為6.89，屬于親水蛋白，預(yù)測

4、其N-末端為信號肽。該蛋白的二級結(jié)構(gòu)以延伸鏈和無規(guī)卷曲為主，其中α-螺旋占15.72％，無規(guī)卷曲占50.63％，延伸鏈占33.65％。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析Hdh-SP與太平洋牡蠣絲氨酸蛋白酶具有較高的保守性并且親緣關(guān)系最近。
　　構(gòu)建了原核重組表達載體pET28a-SP，使用原核表達系統(tǒng)表達并純化出重組Hdh-SP，用于制備兔抗鮑魚絲氨酸蛋白酶的多克隆抗體。構(gòu)建昆蟲細胞重組表達載體，利用昆蟲-桿菌表達系統(tǒng)表達出可溶的Hdh-SP，

5、SDS-PAGE顯示其分子量為30 kDa，與預(yù)測的分子量大小相吻合，Western blot結(jié)果顯示兔抗鮑魚絲氨酸蛋白酶的多克隆抗體與Hdh-SP有很好的的免疫雜交反應(yīng)，且大部分位于胞漿內(nèi)。
　　使用熒光定量PCR與Western blot技術(shù)檢測Hdh-SP在鮑魚血淋巴、肝胰腺、肌肉、性腺、鰓、外套膜等組織的基因和蛋白水平的表達情況。結(jié)果顯示，肝胰腺組織中Hdh-SP基因水平和蛋白水平的表達量明顯高于其他組織。用副溶血弧菌侵染

6、鮑魚之后，其血淋巴細胞內(nèi)Hdh-SP基因水平與蛋白水平都有不同程度上調(diào)，因此推斷Hdh-SP參與鮑魚免疫反應(yīng)。同時，用副溶血弧菌刺激鮑魚之后，發(fā)現(xiàn)與鮑魚免疫密切相關(guān)的四個免疫因子細胞凋亡酶-8(cysteinyl aspartate specific proteinase8，Caspase8)、異體移植炎癥因子(Allograftinflammatory factor，ALInFa)、巨噬細胞表達蛋白(macrophage expres

7、sed protein，MEP)、轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factorκB，Rel/NF-κB)在血淋巴細胞內(nèi)不同程度明顯上調(diào)，說明這四個免疫因子參與到副溶血弧菌侵染后的免疫反應(yīng)中。
　　為了進一步了解Hdh-SP在免疫調(diào)節(jié)方面的作用，采用RNAi技術(shù)沉默Hdh-SP基因。結(jié)果顯示，Hdh-SP的表達被抑制后，Rel/NF-κB、MEP、ALInFa和Caspase8這四個免疫因子基因的相對表達量都會不同程度下降，提示在鮑魚免疫

8、反應(yīng)中，Hdh-SP可能是通過調(diào)控免疫因子的表達來參與免疫調(diào)節(jié)。鮑魚血淋巴細胞凋亡檢測結(jié)果表明當Hdh-SP基因表達受到抑制后，血淋巴細胞的凋亡比例明顯下降，說明Hdh-SP通過調(diào)控Caspase8基因的表達而參與調(diào)控鮑魚血淋巴細胞凋亡。
　　本論文圍繞Hdh-SP在鮑魚先天性免疫反應(yīng)中的作用展開研究。結(jié)果顯示，副溶血弧菌侵染皺紋盤鮑后，Hdh-SP基因與蛋白水平顯著上調(diào)表達。Hdh-SP通過促進Rel/NF-κB基因表達，啟動下