皺紋盤(pán)鮑絲氨酸蛋白酶的基因克隆、體外表達(dá)及其免疫調(diào)控作用.pdf

1、鮑魚(yú)作為中國(guó)傳統(tǒng)名貴海產(chǎn)品，一直受到人們的喜愛(ài)。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)快速增長(zhǎng)以及人們生活水平的提高，鮑魚(yú)的需求量不斷增加，同時(shí)，也帶動(dòng)了鮑魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展。但是，海水污染、高密度養(yǎng)殖等因素導(dǎo)致鮑魚(yú)疾病時(shí)常發(fā)生，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鮑魚(yú)病害的防治已成為鮑魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)中亟待解決的問(wèn)題，其中，副溶血弧菌一直是鮑魚(yú)養(yǎng)殖的主要病原。先天免疫是鮑魚(yú)抵抗病原侵襲的主要途徑。因此，深入探索參與鮑魚(yú)先天性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵基因和蛋白的功能對(duì)于解決鮑魚(yú)病害具有特別重要的

2、意義。
　　前期研究提示，絲氨酸蛋白酶在鮑魚(yú)先天免疫中扮演重要的角色。本研究根據(jù)其他軟體動(dòng)物絲氨酸蛋白酶基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，采用巢式PCR和RACE技術(shù)從皺紋盤(pán)鮑的肝臟組織克隆獲得了絲氨酸蛋白酶(Haliotis discus hanai serine proteinase，Hdh-SP)基因cDNA全長(zhǎng)序列，序列分析結(jié)果顯示Hdh-SP cDNA全長(zhǎng)共1107 bp，包含5'UTR111 bp，3'UTR39 bp，O

3、RF957 bp，編碼319個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)序列比對(duì)結(jié)果顯示，該氨基酸序列與太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)、櫛孔扇貝(Azumapecten farreri)、縊蟶(Sinonovaculaconstricta)和馬氏珠母貝(Pinctada fucata)中絲氨酸蛋白酶的同源性分別為54％、50％、47％和40％。Hdh-SP基因編碼蛋白的預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為34.0 kDa，理論等電點(diǎn)為6.89，屬于親水蛋白，預(yù)測(cè)

4、其N(xiāo)-末端為信號(hào)肽。該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以延伸鏈和無(wú)規(guī)卷曲為主，其中α-螺旋占15.72％，無(wú)規(guī)卷曲占50.63％，延伸鏈占33.65％。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析Hdh-SP與太平洋牡蠣絲氨酸蛋白酶具有較高的保守性并且親緣關(guān)系最近。
　　構(gòu)建了原核重組表達(dá)載體pET28a-SP，使用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化出重組Hdh-SP，用于制備兔抗鮑魚(yú)絲氨酸蛋白酶的多克隆抗體。構(gòu)建昆蟲(chóng)細(xì)胞重組表達(dá)載體，利用昆蟲(chóng)-桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出可溶的Hdh-SP，

5、SDS-PAGE顯示其分子量為30 kDa，與預(yù)測(cè)的分子量大小相吻合，Western blot結(jié)果顯示兔抗鮑魚(yú)絲氨酸蛋白酶的多克隆抗體與Hdh-SP有很好的的免疫雜交反應(yīng)，且大部分位于胞漿內(nèi)。
　　使用熒光定量PCR與Western blot技術(shù)檢測(cè)Hdh-SP在鮑魚(yú)血淋巴、肝胰腺、肌肉、性腺、鰓、外套膜等組織的基因和蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，肝胰腺組織中Hdh-SP基因水平和蛋白水平的表達(dá)量明顯高于其他組織。用副溶血弧菌侵染

6、鮑魚(yú)之后，其血淋巴細(xì)胞內(nèi)Hdh-SP基因水平與蛋白水平都有不同程度上調(diào)，因此推斷Hdh-SP參與鮑魚(yú)免疫反應(yīng)。同時(shí)，用副溶血弧菌刺激鮑魚(yú)之后，發(fā)現(xiàn)與鮑魚(yú)免疫密切相關(guān)的四個(gè)免疫因子細(xì)胞凋亡酶-8(cysteinyl aspartate specific proteinase8，Caspase8)、異體移植炎癥因子(Allograftinflammatory factor，ALInFa)、巨噬細(xì)胞表達(dá)蛋白(macrophage expres

7、sed protein，MEP)、轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factorκB，Rel/NF-κB)在血淋巴細(xì)胞內(nèi)不同程度明顯上調(diào)，說(shuō)明這四個(gè)免疫因子參與到副溶血弧菌侵染后的免疫反應(yīng)中。
　　為了進(jìn)一步了解Hdh-SP在免疫調(diào)節(jié)方面的作用，采用RNAi技術(shù)沉默Hdh-SP基因。結(jié)果顯示，Hdh-SP的表達(dá)被抑制后，Rel/NF-κB、MEP、ALInFa和Caspase8這四個(gè)免疫因子基因的相對(duì)表達(dá)量都會(huì)不同程度下降，提示在鮑魚(yú)免疫

8、反應(yīng)中，Hdh-SP可能是通過(guò)調(diào)控免疫因子的表達(dá)來(lái)參與免疫調(diào)節(jié)。鮑魚(yú)血淋巴細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明當(dāng)Hdh-SP基因表達(dá)受到抑制后，血淋巴細(xì)胞的凋亡比例明顯下降，說(shuō)明Hdh-SP通過(guò)調(diào)控Caspase8基因的表達(dá)而參與調(diào)控鮑魚(yú)血淋巴細(xì)胞凋亡。
　　本論文圍繞Hdh-SP在鮑魚(yú)先天性免疫反應(yīng)中的作用展開(kāi)研究。結(jié)果顯示，副溶血弧菌侵染皺紋盤(pán)鮑后，Hdh-SP基因與蛋白水平顯著上調(diào)表達(dá)。Hdh-SP通過(guò)促進(jìn)Rel/NF-κB基因表達(dá)，啟動(dòng)下