骨髓干細(xì)胞在睪丸中橫向分化可能性的探索.pdf

1、睪丸是雄性個(gè)體最重要的生殖器官，它不僅是精子生成的重要場(chǎng)所，而且還具有分泌雄性激素、維持副性特征的功能。睪丸中主要有三種細(xì)胞——賴氏細(xì)胞、支持細(xì)胞、生殖細(xì)胞。賴氏細(xì)胞位于曲細(xì)精管之間，其分泌的睪酮等雄性激素維持著睪丸內(nèi)外的激素環(huán)境；支持細(xì)胞位于睪丸曲細(xì)精管內(nèi)基底膜附近，它們之間的緊密連接形成血睪屏障，將分化至各階段的生殖細(xì)胞包裹在其中，為精子發(fā)生提供免疫豁免環(huán)境。最近的研究證實(shí)在睪丸中支持細(xì)胞為精原干細(xì)胞提供了一種通用的存活及分化環(huán)境，

2、它不僅可以識(shí)別相同物種的精原干細(xì)胞，而且能識(shí)別不同物種的精原干細(xì)胞，并允許其回到曲細(xì)精管基底膜位置，重新啟動(dòng)增殖、分化過(guò)程。然而，在精子發(fā)生過(guò)程中，究竟支持細(xì)胞提供的微環(huán)境起主導(dǎo)作用還是生殖細(xì)胞本身的分化特性起主導(dǎo)作用尚不清楚。 另外，近年來(lái)干細(xì)胞方面的研究主要集中于胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。盡管胚胎干細(xì)胞因有“發(fā)育全能性”而極具應(yīng)用潛力，但因涉及到倫理問(wèn)題而備受爭(zhēng)議。而成體干細(xì)胞中的骨髓干細(xì)胞不存在倫理學(xué)方面的問(wèn)題，獲取方便，同

3、時(shí)現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)骨髓干細(xì)胞具有可塑性，能橫向分化成多種組織器官細(xì)胞，如骨、軟骨、脂肪、肌肉、肝臟、腎、心臟，甚至腦的細(xì)胞。由此，我們提出問(wèn)題：在睪丸中，外源骨髓干細(xì)胞能否與支持細(xì)胞相互識(shí)別并橫向分化為生殖細(xì)胞啟動(dòng)精子發(fā)生過(guò)程?如果答案是肯定的說(shuō)明在干細(xì)胞分化發(fā)育中微環(huán)境起著關(guān)鍵的作用，相反，說(shuō)明生殖細(xì)胞本身更重要。 鑒于以上認(rèn)識(shí)，本實(shí)驗(yàn)從提取小鼠骨髓干細(xì)胞入手，分別采用睪丸網(wǎng)注射技術(shù)和尾靜脈注射技術(shù)將具有遺傳標(biāo)記的供體骨髓干細(xì)胞移

4、植到去除了內(nèi)源性精原干細(xì)胞的野生型小鼠睪丸中，睪丸曲細(xì)精管為精子發(fā)生提供了一個(gè)特殊的微環(huán)境，同時(shí)也以供體精原干細(xì)胞對(duì)照進(jìn)行相同的移植，觀察骨髓干細(xì)胞在睪丸這個(gè)免疫豁免的特殊環(huán)境中是否能夠增殖及分化。 結(jié)果顯示，對(duì)照組移植80天后，受體小鼠曲細(xì)精管內(nèi)供體精原干細(xì)胞大量增殖并重新啟動(dòng)生精過(guò)程，生成了精子，且交配試驗(yàn)獲得了正常的仔鼠。對(duì)照組移植的結(jié)果說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所使用的睪丸網(wǎng)細(xì)胞移植技術(shù)是成熟的。由于供體細(xì)胞在移植時(shí)是由睪丸網(wǎng)到達(dá)曲細(xì)精

5、管管腔中，而精子發(fā)生卻要首先從基底膜開(kāi)始穿越支持細(xì)胞間形成的緊密連接再到達(dá)管腔，證明異體外源精原干細(xì)胞可以逆向穿越受體小鼠睪丸的血睪屏障，回到基底膜位置重新定位(歸巢)，并可以在支持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)下啟動(dòng)增殖、分化，最終形成精子；亦證明了精原干細(xì)胞的移植確實(shí)能夠使受體小鼠恢復(fù)生育能力，為本研究提供了技術(shù)保障。 實(shí)驗(yàn)組分兩種情況，一是將供體骨髓干細(xì)胞經(jīng)睪丸網(wǎng)移植到受體小鼠睪丸中，二是將供體骨髓干細(xì)胞經(jīng)尾靜脈移植到受體小鼠的血液中。睪

6、丸網(wǎng)移植結(jié)果顯示，移植后的受體小鼠睪丸恢復(fù)了生精過(guò)程，同時(shí)原位PCR技術(shù)進(jìn)一步證明此睪丸中的生殖細(xì)胞來(lái)源于供體骨髓干細(xì)胞，說(shuō)明外源骨髓干細(xì)胞在受體小鼠曲細(xì)精管中可以歸巢和增殖，即可以分化成為生殖細(xì)胞；經(jīng)尾靜脈注射的骨髓干細(xì)胞在受體小鼠睪丸中的分化結(jié)果顯示，移植后6M，常規(guī)檢測(cè)得知野生型受體小鼠曲細(xì)精管上皮仍然很薄(只有一層睪丸支持細(xì)胞)，在睪丸中未見(jiàn)任何供體來(lái)源的細(xì)胞，也沒(méi)有生殖細(xì)胞歸巢或增殖的跡象，說(shuō)明供體骨髓干細(xì)胞不能夠經(jīng)過(guò)血液循環(huán)

7、到達(dá)睪丸管腔中。由上可知，將外源骨髓干細(xì)胞經(jīng)睪丸網(wǎng)移植到去除了內(nèi)源性精原干細(xì)胞受體小鼠睪丸后，它們可以逆向通過(guò)睪丸的血睪屏障到達(dá)曲細(xì)精管基底膜(歸巢)，橫向分化成為生殖細(xì)胞啟動(dòng)精子發(fā)生過(guò)程，即支持細(xì)胞可以識(shí)別外源的骨髓干細(xì)胞，允許其歸巢，重新啟動(dòng)增殖、分化過(guò)程。但經(jīng)尾靜脈注射的骨髓干細(xì)胞則無(wú)法到達(dá)睪丸的曲細(xì)精管內(nèi)。 本課題采用睪丸網(wǎng)注射技術(shù)和尾靜脈注射技術(shù)研究外源骨髓干細(xì)胞與睪丸內(nèi)微環(huán)境的相互關(guān)系及其橫向分化潛能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)血

8、液移植骨髓干細(xì)胞無(wú)法使其在受體睪丸中歸巢并增殖、分化，而通過(guò)睪丸網(wǎng)移植骨髓干細(xì)胞能夠使其在受體睪丸中歸巢并增殖、分化，說(shuō)明在骨髓成體干細(xì)胞的分化過(guò)程中其微環(huán)境具有關(guān)鍵的作用，它可以誘導(dǎo)干細(xì)胞改變分化方向或進(jìn)程即橫向分化。。本研究不僅為最終闡明睪丸內(nèi)細(xì)胞間的相互作用提供可靠的依據(jù)；而且對(duì)探討骨髓干細(xì)胞的橫向分化潛能具有重要的理論意義，同時(shí)為后續(xù)成體干細(xì)胞橫向分化技術(shù)的研究打下基礎(chǔ)，也為推動(dòng)成體干細(xì)胞的臨床應(yīng)用起到積極的作用，可為男性不育患