人PDCD4啟動(dòng)子的確定及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的初步研究.pdf

1、目的:
　　 程序性細(xì)胞死亡，又稱為細(xì)胞凋亡，在生物體發(fā)育過程中具有很重要的作用。程序性細(xì)胞死亡因子4(programmed cell death4，PDCD4)最初是在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的在細(xì)胞凋亡中表達(dá)上調(diào)的基因，后來陸續(xù)在雞、大鼠、人類中發(fā)現(xiàn)給基因的同源物。目前對于該基因在細(xì)胞凋亡中所起到的具體作用和機(jī)制尚不清楚。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，PDCD4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，目前的證據(jù)說明PDCD4是一個(gè)新的抑癌基因，可以作為一個(gè)抗

2、腫瘤治療中潛在的靶基因。
　　 方法:
　　 一、人PDCD4啟動(dòng)子全長的克隆及其啟動(dòng)活性的分析。
　　 1、人PDCD4啟動(dòng)子區(qū)的預(yù)測；
　　 為了克隆PDCD4的啟動(dòng)子，首先利用MatInspector、FirstEF、ProscanPrediction軟件對人PDCD4基因5’端-2500～+500段（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為+1）進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測。
　　 2、人PDCD4啟動(dòng)子區(qū)克隆及報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建、

3、鑒定；
　　 結(jié)合啟動(dòng)子預(yù)測結(jié)果，選定長898bp的-548～+350片段，設(shè)計(jì)合適的引物，同時(shí)引入酶切位點(diǎn)KpnⅠ、BglⅡ，以人基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物雙酶切后克隆入pGL4-Basic相應(yīng)酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pGL4-PDCD4-P1，測序分析。
　　 3、RT-PCR和Western blotting檢測內(nèi)源性PDCD4在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)；
　　 為了在細(xì)胞中檢測PDCD4啟動(dòng)子的活性，

4、我們分別采用RT-PCR和WesternBlot法從RNA和蛋白質(zhì)水平檢測了PDCD4在4種卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)狀態(tài)，以篩選適合的細(xì)胞模型。
　　 二、PDCD4核心啟動(dòng)子的確定。
　　 1、以pGL4-PDCD4-P1為模板構(gòu)建一系列PDCD4-P1截短載體
　　 為了確定PDCD4核心啟動(dòng)子，對PDCD4-P1進(jìn)行一系列截短。分別選定PDCD4基因-315～+350、+10～+350、-315～+1、-164

5、～+1、-114～+1、-67～+1片段，以pGL4-PDCD4-P1為模板，PCR擴(kuò)增，命名為P2 P3 P4 P5 P6 P7，亞克隆入pGL4-Basic載體構(gòu)建相應(yīng)截短載體。
　　 2、報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及雙熒光活性分析
　　 將上述構(gòu)建的報(bào)告質(zhì)粒及pGL4-Basic（陰性對照）分別與pRL-TK（內(nèi)參照）瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3、SKOV3，方法同上，每種質(zhì)粒設(shè)2復(fù)孔，同一轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

6、　　 三、人PDCD4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 1、人PDCD4啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測與分析
　　 為了研究PDCD4轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，利用MatInspector軟件對人PDCD4基囚5’端-600～+400區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析
　　 2、PDCD4啟動(dòng)子截短載體的構(gòu)建與雙熒光素酶活性的檢測
　　 為了研究PDCD4轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，對PDCD4啟動(dòng)子區(qū)3’端進(jìn)行截短，選定-548～+2

7、23、-315～+223片段，分別以pGL4-PDCD4-P1、P2為模板，PCR擴(kuò)增，命名為PDCD4-P8、P9，克隆入pGL4-Basic載體構(gòu)建pGL4-PDCD4-P8、P9，雙酶切、測序鑒定。
　　 將上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒和pGL4-Basic-P1、P2進(jìn)行雙熒光素酶檢測，方法同上。每種質(zhì)粒設(shè)2復(fù)孔，同一轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。
　　 3、構(gòu)建PDCD43’端RREB結(jié)合位點(diǎn)截短載體以及RREB結(jié)合位點(diǎn)突變報(bào)告

8、載體并進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測。
　　 結(jié)果：
　　 一、人PDCD4啟動(dòng)子全長的克隆及其啟動(dòng)活性的分析。
　　 1、軟件預(yù)測初步確定了人PDCD4可能的啟動(dòng)子區(qū)；
　　 為了確定PDCD4的啟動(dòng)子，我們用三個(gè)軟件對其進(jìn)行了預(yù)測。在線軟件MatInspector分析結(jié)果顯示，-500～+191段為PDCD4啟動(dòng)子區(qū)，該區(qū)域含有4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子SP1結(jié)合位點(diǎn)；FirstEF預(yù)測結(jié)果顯示-262～+307段為啟動(dòng)子

9、區(qū)；Proscan Prediction軟件預(yù)測結(jié)果顯示+25～+275段位啟動(dòng)子區(qū)。綜合上述三個(gè)軟件的分析結(jié)果，最終選定了包含所有預(yù)測結(jié)果的-548～+350段為假定人PDCD4啟動(dòng)子區(qū)，命名為PDCD4-P1。
　　 2、人PDCD4啟動(dòng)子區(qū)的克隆及報(bào)告質(zhì)粒pGL4-PDCD4-P1構(gòu)建、鑒定
　　 為了獲得PDCD4啟動(dòng)子區(qū)PDCD4-P1，我們以正常人基因組DNA為模板，利用特異性引物對PDCD4-548～+35

10、0段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示一條PDCD4-P1(898bp)的特異DNA片段，目的片段電泳回收后，經(jīng)KpnI、BglⅡ雙酶切，連接至pGL4-Basic載體的KpnⅠ、BglⅡ酶切位點(diǎn)間，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化以及LA平板篩選后挑取單克隆菌落，堿變性法抽提重組質(zhì)粒。
　　 3、不同卵巢癌細(xì)胞系PDCD4的表達(dá)情況。
　　 為了找到合適的細(xì)胞模型，檢測了不同卵巢癌細(xì)胞系PDCD4的表達(dá)情況。RT-PCR結(jié)果顯示OVCAR3細(xì)

11、胞系中PDCD4 mRNA表達(dá)較高，而其它三種細(xì)胞系低表達(dá)PDCD4 mRNA; Western blot結(jié)果顯示OVCAR3細(xì)胞系高表達(dá)PDCD4蛋白，而SKOV3、CAOV3和3AO細(xì)胞系中PDCD4陽性條帶亮度明顯較弱。
　　 4、報(bào)告質(zhì)粒pGL4-PDCD4-P1雙熒光活性分析。
　　 雙熒光素酶分析證實(shí)，pGL4-PDCD4-P1在OVCAR3，SKOV3細(xì)胞系中均具有啟動(dòng)子活性，其M1/M2比值分別為pGL4

12、-Basic空載體的67倍和15倍。其中，在高表達(dá)內(nèi)源性PDCD4的OVCAR3細(xì)胞中，PDCD4-P1啟動(dòng)子活性明顯高于低表達(dá)PDCD4的SKOV3細(xì)胞。該部分結(jié)果說明，PDCD4-P1已經(jīng)包含具有啟動(dòng)活性的區(qū)段，PDCD4啟動(dòng)子克隆成功。
　　 二、PDCD4核心啟動(dòng)子的確定。
　　 1、PDCD4-P1一系列截短片段的重組報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建成功；
　　 為了確定PDCD4核心啟動(dòng)子，對PDCD4-P1進(jìn)行一系列截

13、短。分別選定PDCD4基因-315～+350、+10～+350、-315～+1、-164～+1、-114～+1、-67～+1片段，以pGL4-PDCD4-P1為模板，PCR擴(kuò)增，命名為P2 P3 P4 P5 P6 P7，電泳結(jié)果均與預(yù)測相符。
　　 2、報(bào)告質(zhì)粒的雙熒光活性分析及PDCD4核心啟動(dòng)子區(qū)的確定。
　　 雙熒光素酶結(jié)果顯示，上述重組報(bào)告質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染PDCD4高表達(dá)的OVCAR3細(xì)胞系后，P2(-315～+350

14、)、P4(-315～+1)、P5(-164～+1)均具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子活性，約為pGL4-Basic空載體的40倍左右，隨著PDCD45’端的截短，P6(-114～+1)啟動(dòng)子活性開始下降，約為空載體的13倍，當(dāng)截短到-67位點(diǎn)時(shí)，P7(-67～+1）啟動(dòng)活性完全喪失。
　　 三、人PDCD4轉(zhuǎn)錄調(diào)控的初步研究。
　　 1、結(jié)合PDCD4啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子的分析及預(yù)測；
　　 利用在線軟件MatInspector分析

15、PDCD45’端轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)PDCD4核心啟動(dòng)子區(qū)(-164～-67段)發(fā)現(xiàn)3個(gè)潛在的SP1結(jié)合位點(diǎn)(-151、-145、-72)，此外PDCD4核心啟動(dòng)子兩側(cè)存在若干個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，以下為部分分析參數(shù)高于0.90并且參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的TFBSs:NF-kB(-445)、RREB(-153)、IRFF(+66)、RREB(+239)、RREB(+283)、RREB(+293)。
　　 2、SP1對PDCD4轉(zhuǎn)

16、錄活性的影響。
　　 轉(zhuǎn)錄因子SP1通常負(fù)責(zé)維持PDCD4的基礎(chǔ)水平轉(zhuǎn)錄，我們在PDCD4核心啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)SP1結(jié)合位點(diǎn)(-151、-145、-72)，結(jié)合前期截短實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，PDCD4-P5(-164～+1)具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子活性，隨著PDCD45’端的截短，去除了兩個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)(-151、-145)的P6(-114～+1)啟動(dòng)子活性開始下降，約為空載體的13倍，當(dāng)截短到-67位點(diǎn)使3個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)均缺失后，

17、P7(-67～+1)啟動(dòng)活性完全喪失。提示3個(gè)SP1有可能共同負(fù)責(zé)維持PDCD4的基礎(chǔ)水平轉(zhuǎn)錄。
　　 3、NF-kB對PDCD4轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　 為了研究NF-kB對PDCD4轉(zhuǎn)錄活性的影響，我們通過對PDCD4啟動(dòng)子的截短而去除NF-kB結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶檢測其對PDCD4啟動(dòng)活性的影響。
　　 4、成功構(gòu)建PDCD4啟動(dòng)子3’端系列截短載體以及定點(diǎn)突變報(bào)告載體。
　　 為了研究PDCD4轉(zhuǎn)錄

18、調(diào)控機(jī)制，設(shè)計(jì)特異性引物對軟件預(yù)測的PDCD4轉(zhuǎn)錄因子密集的區(qū)域進(jìn)行截短，構(gòu)建重組報(bào)告質(zhì)粒。酶切、測序結(jié)果均證實(shí)重組截短載體pGL4-PDCD4-P8(-548～+223)、pGL4-PDCD4-P9(-315～+223)、pGL4-PDCD4-P10(-315～+292)和定點(diǎn)突變載體pGL4-PDCD4-P1-RREB3mut構(gòu)建成功。
　　 結(jié)論：
　　 1.本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了一系列含人PDCD4啟動(dòng)子的螢火蟲熒光素