鵝垂體特異性轉錄因子(PIT-1)基因啟動子的克隆及調控區(qū)的初步鑒定.pdf

1、垂體特異性轉錄因子1(PIT-1)是重要的組織特異性轉錄因子,也是調控垂體內GH、PRL、TSH-β轉錄的重要反式作用因子,對動物早期的發(fā)育和相關基因表達調控起重要的作用,認為是與生長相關和作為研究動物生長機制的重要候選基因之一。但目前在畜禽上,該基因研究還不夠深入,尤其是對該基因的轉錄調控水平的研究,本研究以鵝為實驗對象,成功地克隆了PIT-1基因啟動子區(qū)序列,并對該區(qū)域從轉錄調控方面進行初步研究。
　　 1.鵝PIT-1基因

2、啟動子區(qū)域克隆及序列分析
　　 本實驗利用基因組步移技術,首次從鵝基因組中克隆到了共約3.0kb的PIT-1基因5'啟動子區(qū)序列,序列已提交到Genbank(序列號:EU924269)。
　　 利用在線軟件對所得結果進行了序列分析和物種間PIT-1基因5'啟動子區(qū)序列比對和系統(tǒng)進化樹構建。結果表明所克隆的片段中含有兩段啟動子,分別命名為近端和遠端啟動子,且都含有典型的TATA框和CAAT框,還預測到一些轉錄元件,如myo

3、genin,TFIID,GATA-1,AP-1,GR,HOXD10,TCF-4E,PRA,Sp1,POU1F1a,POU3F2,GATA-4,Foxj2等。序列比對結果表明,不同物種PIT-1基因的同源序列主要集中在轉錄起始點上游-200bp至-1000bp區(qū)域。轉錄起始點上游-200bp區(qū)域保守性比較強,很可能為核心啟動子序列,且鵝與雞的同源性最高。同時,本實驗使用Vista中的MLAGAN程序構建的系統(tǒng)進化樹,結果反映了不同物種間進

4、化關系。
　　 2.啟動子區(qū)功能的鑒定和轉錄調控的研究
　　 利用基因組步移獲得了鵝PIT-1基因的啟動子區(qū)序列,采用了系列缺失法成功構建了一系列啟動子缺失突變體(-2995/-1 bp,-1485/-1 bp,-1293/-1 bp,-1014/-1bp,-775/-1 bp,-561/-1 bp,-353/-1 bp,-206/-1 bp),使用構建熒光素酶報告基因載體和瞬時轉染分析法進行啟動子區(qū)活性的檢測和轉錄調控