豬肌肉生長(zhǎng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的克隆、啟動(dòng)子調(diào)控及遺傳效應(yīng)分析.pdf

1、肌肉調(diào)節(jié)因子(MRFs)和生肌增強(qiáng)因子2(MEF2)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族組成的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著決定性的調(diào)控作用。MRFs家族包括MyoD、MyoG、Myf5和Myf6；MEF2家族包括MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D。MRFs的結(jié)合位點(diǎn)與MEF2的結(jié)合位點(diǎn)在肌肉組織特異性基因的調(diào)控區(qū)普遍存在。MRFs通過與E蛋白家族的另一類bHLH蛋白形成異二聚體識(shí)別并結(jié)合MEF2基因5’UTR上的E-box，從而誘導(dǎo)啟

2、動(dòng)MEF2基因的表達(dá)。而MEF2又可以結(jié)合于MRFs基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的MEF2序列，放大和維持MRFs的基因表達(dá)。兩家族轉(zhuǎn)錄因子互相作用形成一個(gè)正向反饋環(huán)，從而共同調(diào)控肌肉特異性基因的表達(dá)，決定肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育。因此，本研究對(duì)豬MRFs和MEF2兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族基因進(jìn)行了分離、克隆、啟動(dòng)子調(diào)控和遺傳效應(yīng)分析，取得了以下結(jié)果： 1．豬MEF2A、MEF2C和Myf6基因cDNA序列的分離和克?。翰捎秒娔X克隆和RACE技術(shù)，克隆MEF2

3、A和MEF2C基因cDNA全長(zhǎng)序列以及Myf6基因的3’UTR序列，其中MEF2A基因GenBank登錄號(hào)為EF194143，cDNA全長(zhǎng)2818 bp，ORF為1416 bp，編碼472個(gè)氨基酸，5’UTR長(zhǎng)360 bp，3’UTR長(zhǎng)1042 bp；MEF2C基因GenBank登錄號(hào)為EF486522，cDNA全長(zhǎng)4365bp，ORF為1392 bp，編碼464個(gè)氨基酸，5’UTR有363 bp，3’UTR長(zhǎng)2610 bp；Myf6基

4、因GenBank登錄號(hào)為DQl39774，3’UTR長(zhǎng)638bp。 2．豬MEF2A和MEF2C基因的生物信息學(xué)分析：利用Clustal X、ORFFinder、SignalP2.0、ANTHEPORT、PSORTII、TMprep等軟件對(duì)豬MEF2A和MEF2C基因結(jié)構(gòu)、所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能、系統(tǒng)進(jìn)化等特征進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析，并構(gòu)建了分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。 3．豬MEF2C基因的選擇性剪切體鑒定：設(shè)計(jì)引物以豬肌肉組織cDN

5、A為模板擴(kuò)增得到大小不同的片段。經(jīng)測(cè)序和序列分析證實(shí)不同帶型分別代表豬MEF2C的兩種不同剪切體MEF2C-1和MEF2C-2。剪切體MEF2C-1比MEF2C-2多96bp的核苷酸序列，相差32個(gè)氨基酸，同時(shí)對(duì)豬MEF2C-1和MEF2C-2兩種轉(zhuǎn)錄本所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能、系統(tǒng)進(jìn)化等特征進(jìn)行了預(yù)測(cè)和比較，并構(gòu)建了分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。 4．MEF2A和MEF2C基因的部分基因組序列的獲得及SNP的發(fā)現(xiàn)：根據(jù)已獲得的cDNA序列，

6、擴(kuò)增了MEF2A和MEF2C基因的部分內(nèi)含子序列，并分析了其在不同豬種中的多態(tài)性。MEF2A基因第6內(nèi)含子長(zhǎng)度為1001bp，在其上發(fā)現(xiàn)了5個(gè)SNP位點(diǎn)，顛換突變2個(gè)，轉(zhuǎn)換突變3個(gè)。其中A157G變異，引起了限制性內(nèi)切酶MspI的酶切位點(diǎn)變化；MEF2C基因第7和8內(nèi)含子分別為2556bp和756bp，在其上發(fā)現(xiàn)了5個(gè)SNP位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換突變3個(gè)，插入缺失突變2個(gè)。所有內(nèi)含子5’端都為GT，3’端都為AG，符合“GT-AG”法則。

7、5．MEF2C、Myf5和Myf6基因啟動(dòng)子序列的獲得及生物信息學(xué)分析：利用基因組PCR步移法從豬的基因組中擴(kuò)增出了MEF2C和Myf5基因5’側(cè)翼2427bp和1970bp的序列。利用比較基因組法從豬的基因組中擴(kuò)增出了Myf6基因5’側(cè)翼1089bp的序列。利用NNPP、MethPrimer、TESS等生物信息學(xué)軟件對(duì)豬MEF2C、Myf5和Myf6基因的核心啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、CpG島的分布以及與啟動(dòng)子相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了預(yù)測(cè)和

8、分析。另外，在Myf6基因的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)13處SNP，顛換突變3個(gè)，轉(zhuǎn)換突變9個(gè)，插入/缺失突變1個(gè)。 6．豬Myf5、MyoD、Myf6基因部分DNA序列的SNP篩查：(1)Myf5，發(fā)現(xiàn)了26個(gè) P位點(diǎn)，顛換突變6個(gè)，轉(zhuǎn)換突變11個(gè)，插入/缺失突變9個(gè);(2)MyoD，發(fā)現(xiàn)了8個(gè)SNP位點(diǎn)，顛換突變4個(gè)，轉(zhuǎn)換突變4個(gè)；(3)Myf6，發(fā)現(xiàn)了8個(gè)SNP位點(diǎn)，顛換突變4個(gè)，轉(zhuǎn)換突變4個(gè)。 7．Myf5、MyoD、Myf6

9、和MEF2A的遺傳效應(yīng)分析：利用PCR-RFLP分子標(biāo)記技術(shù)，以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)豬場(chǎng)2002年屠宰的大白豬、長(zhǎng)白豬和梅山豬等三個(gè)品種和大白豬×長(zhǎng)白豬、長(zhǎng)白豬×大白豬、大白豬×梅山豬、梅山豬×大白豬等四個(gè)雜交組合群體(共321頭)以及2000、2003、2004年屠宰的大白豬×梅山豬雜種豬F<,2>代群體(共403頭)為試驗(yàn)豬群，對(duì)豬MRFs和MEF2兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族基因Myf5、MyoD、Myf6和MEF2A中存在的SNP進(jìn)行了驗(yàn)證與基

10、因型分型，與胴體、肉質(zhì)等經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，Myf6-BcnI-RFLP的不同基因型主要與屠宰率和瘦肉率顯著相關(guān)，且瘦肉率的加性效應(yīng)顯著；Myf5-Hsp92II-RFLP的不同基因型主要與肥肉率、肩部最厚處膘厚、胸腰椎間膘厚、平均膘厚、至第一肋胸胴體長(zhǎng)、肌內(nèi)脂肪和肌內(nèi)水分顯著和極顯著相關(guān)，其中胸腰椎間膘厚、至第一肋胸胴體長(zhǎng)、肌內(nèi)水分的加性效應(yīng)顯著；Myf5-HinfI-RFLP的不同基因型主要與背最長(zhǎng)肌pH值接近顯著相關(guān)；M

11、yf5-MspI-RFLP的不同基因型主要與6-7胸椎間膘厚、胸腰椎間膘厚、至第一肋胸胴體長(zhǎng)和背最長(zhǎng)肌pH顯著相關(guān)，其中6-7胸椎間膘厚、背最長(zhǎng)肌pH的加性效應(yīng)顯著；MyoD-DdeI-RFLP的不同基因型主要與至第一肋胸胴體長(zhǎng)和6-7胸椎間膘厚顯著相關(guān)；Myf6-TasI-RFLP的不同基因型主要與瘦肉率接近顯著相關(guān)，與背最長(zhǎng)肌pH、背最長(zhǎng)肌大理石紋和股二頭肌大理石紋性狀顯著相關(guān)，其中背最長(zhǎng)肌大理石紋和股二頭肌大理石紋的加性效應(yīng)顯著；