靶向survivin的siRNA對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及增強(qiáng)絲裂霉素敏感性的實驗研究.pdf

1、研究背景：以手術(shù)為主的綜合治療是目前處理原發(fā)性肝癌的主要模式。化療和化療相關(guān)治療在肝癌的綜合性治療中發(fā)揮重要的作用。藥物耐受是影響肝癌綜合治療的重要因素。肝癌細(xì)胞中相關(guān)基因的異常表達(dá)所致細(xì)胞凋亡障礙是藥物耐受的原因之一。Survivin基因是凋亡抑制蛋白家族成員之一，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和藥物耐受密切相關(guān)，但其在化療藥物所致肝癌細(xì)胞耐受過程中的作用目前國內(nèi)外研究較少。采取有效措施抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制基因的表達(dá)并增強(qiáng)相關(guān)藥物的作

2、用是目前研究的熱點。RNA干擾是生物體保持其自身遺傳性狀的穩(wěn)定和調(diào)控后生型突變的一種生理現(xiàn)象。作為一種古老的保護(hù)機(jī)制，RNAi不僅可以抵御外源有害基因入侵，而且將其作為一種解讀基因功能的研究技術(shù)還可能為功能基因組學(xué)、基因治療學(xué)等眾多領(lǐng)域帶來新的突破。目前RNA干擾在理論上有望成為一種新的腫瘤基因治療方案。運(yùn)用RNA干擾技術(shù)抑制肝癌細(xì)胞中異常表達(dá)的Survivin基因并增強(qiáng)化療藥物的敏感性可能為肝癌的治療帶來新的思路。 目的：通過

3、測定絲裂霉素作用肝癌細(xì)胞過程中Survivin的表達(dá)變化探明肝癌細(xì)胞可能的耐藥機(jī)理。構(gòu)建靶向survivin的真核表達(dá)載體，經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞并建立細(xì)胞系后觀察其對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及增強(qiáng)絲裂霉素對肝癌細(xì)胞作用的可能性。 方法：在培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株HepG2中加入低濃度絲裂霉素，于不同時間點收集細(xì)胞后運(yùn)用RT-PCR以及免疫印跡法檢測survivinmRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。根據(jù)RNA干擾的設(shè)計原則設(shè)計、合成一對survi

4、vin編碼基因的反向重復(fù)序列，中間間隔9個核苷酸序列，通過定向克隆至載體PSilencer2.1，構(gòu)建siRNA真核表達(dá)載體。核酸測序方法鑒定構(gòu)建質(zhì)粒的正確性。應(yīng)用RT-PCR及流式細(xì)胞技術(shù)檢測siRNA對肝癌細(xì)胞中survivinmRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制情況。將此siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞并建立細(xì)胞系。以此細(xì)胞系為研究平臺，通過臺盼藍(lán)染色對肝癌細(xì)胞的生長進(jìn)行分析，通過細(xì)胞凋亡—Hoechst染色觀察肝癌細(xì)胞的凋亡形

5、態(tài)，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)計算凋亡率。進(jìn)行裸鼠異體腫瘤接種實驗，觀察腫瘤的生長狀況并測量計算腫瘤的體積，繪制腫瘤生長曲線并計算成瘤率。繼續(xù)以此細(xì)胞系為研究平臺，以MTT法檢測化療藥物絲裂霉素作用的敏感性。以免疫印跡法檢測絲裂霉素作用于不同細(xì)胞、不同時間點下Survivin蛋白的表達(dá)情況。采用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒及Caspase活性檢測試劑盒對絲裂霉素作用于不同細(xì)胞、不同時間點下凋亡率及Caspase-3活性進(jìn)行檢測。 結(jié)果：肝癌細(xì)胞株加

6、入絲裂霉素12h未見survivin明顯表達(dá)改變，24、48h后可檢測到survivinmRNA表達(dá)較加藥前分別增加1.30、1.69倍，蛋白質(zhì)表達(dá)增加1.18、1.28倍，均有顯著差異。核酸測序證實siRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。通過RT-PCR及流式細(xì)胞術(shù)檢測，siRNA在mRNA及蛋白質(zhì)水平抑制survivin基因表達(dá)分別達(dá)73％和75％。轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長速度明顯減慢，凋亡率增加2.68倍。裸鼠體內(nèi)成瘤率下降75％，9～30d腫瘤體積

7、與對照組相比差異顯著。MTT法觀測到當(dāng)survivin的表達(dá)被有效抑制后，肝癌細(xì)胞在絲裂霉素作用下12h的存活率即出現(xiàn)明顯抑制，并且在48h時達(dá)到高峰。免疫印跡法檢測顯示未加絲裂霉素之前survivin蛋白的表達(dá)和加入絲裂霉素后的表達(dá)存在差異。流式技術(shù)及Caspase活性檢測顯示各時間點陽性對照組凋亡率及活性增加。 結(jié)論：絲裂霉素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞Survivin表達(dá)升高具有時間效應(yīng)，Survivin表達(dá)升高可能在肝癌細(xì)胞耐藥過程中發(fā)