靶向Plk1的siRNA對肝癌BEL-7402細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響及增強(qiáng)長春新堿化療敏感性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩107頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、研究背景:原發(fā)性肝癌是(以下簡稱肝癌),是我國常見的惡性腫瘤之一,以手術(shù)為主聯(lián)合化療、放療是目前治療肝癌的主要模式。由于肝癌對化療不太敏感,因此,如何降低化療藥物的毒性并增強(qiáng)化療效果,值得進(jìn)一步深入地研究。而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,利用基因研究的進(jìn)展對肝癌進(jìn)行基因治療,為肝癌的治療提供了新的策略。 Hk1(Polo-like kinase 1)基因?qū)儆谟薪z分裂絲氨酸/蘇氨酸激酶家族PlKs(Polo-like kinases)

2、中的一員,是G<,2>/M期DNA損傷檢測點(diǎn)重要激酶,對中心體的成熟,雙極紡錘體的形成,及胞漿分裂等起重要作用。PR1作為參與細(xì)胞分裂啟動和正性推進(jìn)者,在細(xì)胞增殖過程中起重要作用。在多種腫瘤中,P1k1常表現(xiàn)為過表達(dá)并與不良預(yù)后密切相關(guān)。肝癌往往發(fā)生于慢性肝病,如肝硬化和慢性肝炎,這類疾病由于肝臟損傷后伴有持續(xù)的肝細(xì)胞增殖,細(xì)胞增殖加速使肝細(xì)胞增殖周期中的調(diào)控基因更容易發(fā)生隨機(jī)改變,同時細(xì)胞增殖加速也容易使慢性肝病過程中致病因子所導(dǎo)致的

3、DNA突變得以保留并迅速克隆性擴(kuò)張,最后導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。因此,我們選定PR1作為潛在的腫瘤基因治療靶點(diǎn),調(diào)控G<,2>/M期的DNA損傷檢測點(diǎn)功能,以期達(dá)到抑制腫瘤生長、增殖的目的。 RNA干擾(RNA interferenCe,RNAi)技術(shù)是近年來出現(xiàn)的一種高效地封閉特異性基因的新技術(shù),近年來無論在功能基因組研究還是腫瘤的基因治療等方面得到廣泛的應(yīng)用。RNAi是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的Mrna發(fā)生

4、特異性降解,導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默,產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。因此,運(yùn)用RNA干擾技術(shù)抑制肝癌細(xì)胞內(nèi)異常表達(dá)的Plkl基因從而影響其生物學(xué)行為并增強(qiáng)化療藥物敏感性可能為肝癌的治療帶來新的思路。 第一章 P1k1在肝癌組織中表達(dá)及臨床意義。 目的:探討P1k1在原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌中的表達(dá)及其意義。 方法:用半定量RT-PCR、Western blot的方法檢測21例原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌中P1k1的表達(dá)情況,并分析其與肝癌

5、臨床病理因素的關(guān)系。同時取肝硬化及正常肝組織各7例做對照。 結(jié)果:肝癌組織中P1k1mRNA表達(dá)比值(P1k1/β-actin)為0.572±0.144,明顯高于肝硬化組織中的0.250±0.057和正常肝組織的0.218±0.073(P<0.01)。P1k1 Mrna表達(dá)水平在腫瘤直徑大于5cm組中為0.641±0.110,而在腫瘤直徑小于5cm組中為0.458±0.120,兩組之間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。其在有門靜

6、脈癌栓患者中的表達(dá)為0.652±0.107,明顯高于無門靜脈癌栓者中的表達(dá)0.522±0.144。(P<0.05)。而與有無包膜,腫瘤病理分級和AFP陽性與否無明顯相關(guān)。肝癌組織P1k1蛋白表達(dá)明顯高于肝硬化及正常肝組織中的P1k1蛋白表達(dá)量。 結(jié)論: 1.原發(fā)性肝癌組織中P1k1mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增加; 2.P1k1的表達(dá)高低與原發(fā)性肝癌的腫瘤直徑大小及脈管侵犯有明顯相關(guān)。 第二章靶向P1k1的s

7、hRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建和鑒定。 目的:構(gòu)建靶向P1k1的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)真核表達(dá)載體。 方法:設(shè)計合成兩條針對P1k1的短發(fā)夾狀RNA.及一條陰性對照無意義短發(fā)夾狀RNA,將其導(dǎo)入pGenesil-2質(zhì)粒中。用菌液PCR、質(zhì)粒雙酶切及重組質(zhì)粒測序的方法,檢驗(yàn)構(gòu)建載體的正確性。 結(jié)果:分別合成針對P1k1基因251-269及1396—1417位點(diǎn)的siRNA序列及陰性序列,成功將其導(dǎo)入真核表達(dá)載體,經(jīng)

8、菌液PCR、質(zhì)粒雙酶切及重組質(zhì)粒測序,均顯示siRNA序列已成功裝入載體。 結(jié)論:構(gòu)建攜帶針對P1k1基因shRNA真核表達(dá)載體成功。 第三章靶向P1k1的siRNA對肝癌BEL-7402細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響。 目的:利用RNA(RNAi)干擾技術(shù),研究表達(dá)P1k1的短發(fā)夾RNA(shRNA)載體對肝癌細(xì)胞株BEL-7402生物學(xué)行為的影響。 方法:根據(jù)靶基因的不同區(qū)域設(shè)計兩組shRNA以及一個陰性對照

9、,利用電穿孔法轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞株BEL-7402,獲得穩(wěn)定表達(dá)的克隆后,半定量RT-PCR檢測肝癌細(xì)胞株BEL-7402的P1k1、Cdc25C、p53mRNA的變化,Western blot檢測P1k1蛋白的表達(dá),MTT法檢測細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化。 結(jié)果:利用電穿孔將載體轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞株BEL-7402,利用G418篩選,獲得穩(wěn)定表達(dá)的克隆。半定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染shRNA載體的BEL-7402細(xì)胞的P1k1表

10、達(dá)情況,P1k1siRNA-251,P1klsiRNA-1396,P1k1siRNA-hk轉(zhuǎn)染組與對照組分別為0.184±0.014;0.218±0.043:0.683±0.071:0.729±0.053。檢測p53mRNA分別為0.425±0.052;0.400±0.056;0.180±0.027;0.174±0.027。檢測Cdc25C Mrna分別為0.387±0.083;0.353±0.059;0.816±0.052;0.837

11、±0.065。Western blot檢測BEL--7402細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA載體后的Hkl蛋白的表達(dá)分別為0.032±0.007、0.040±0.008、0.272±0.041、0.278±0.053。MTT檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染shRNA載體后BEL--7402細(xì)胞增殖明顯減慢。細(xì)胞周期檢測證實(shí)轉(zhuǎn)染P1k1siRNA可以引起B(yǎng)EL-7402細(xì)胞G0/G1期減少,G<,2>/CM期增高,而對S期影響不大。 結(jié)論: 1.成功篩選出

12、兩條能特異而高效抑制PRl基因表達(dá)的shRN,為進(jìn)一步研究該基因的功能和作用機(jī)制提供了新的手段; 2.用電穿孔法篩選出穩(wěn)定表達(dá)PRl siRNA的載體的BEL-7402細(xì)胞克隆,發(fā)現(xiàn)其可以顯著抑制Hkl Mrna的表達(dá);并能引起p53mRNA的升高與Cdc25C Mrna的下降; 3.用電穿孔法篩選出穩(wěn)定表達(dá)PRl siRNA的載體的BEL-7402細(xì)胞克隆,發(fā)現(xiàn)其可以顯著抑制Hkl蛋白的表達(dá); 4.BEL-74

13、02細(xì)胞轉(zhuǎn)染PRl siRNA.載體后,可明顯抑制細(xì)胞增殖;改變細(xì)胞周期分布。 第四章靶向P1k1的siRNA對肝癌BEL-7402細(xì)胞株化療敏感性影響的實(shí)驗(yàn)研究。 目的:利用RNA(RNAi)干擾技術(shù),研究表達(dá)靶向P1k1的短發(fā)夾RNA(shRNA)載體對肝癌細(xì)胞株BEL-7402化療敏感性的影響。 方法:將P1klsiRNA-251,P1k1siRNA-1396,P1k1siRNA-hk轉(zhuǎn)染組與對照組的BEL

14、-7402細(xì)胞作為研究對象,用長春新堿處理細(xì)胞后,用MTT法檢測四組細(xì)胞的生長抑制率,計算IC<,60>值,流式細(xì)胞儀和Hoechest染色法檢測各組細(xì)胞凋亡。 結(jié)果:長春新堿處理后, P1k1siRNA-251組和P1k1siRNA-1396組與BEL7402組之間的生長抑制率有顯著性差異(P<0.01)。P1k1siRNA-hk組與BEL7402組之間的生長抑制率無顯著性差異(P>0.05)。P1k1siRNA-251組的I

15、C<,50>為14.541ug/ml,較P1k1siRNA-hk組IC<,50>22.380ug/ml降低35.02%,較BEL7402組IC<,50>21.176 ug/ml降低31.33%;而P1k1siRNA-1396組的IC<,50>為13.413ug/ml,較P1klsiRNA-hk組IC<,50>降低40.07%,較BEL7402組IC5。降低36.66%。5ug/ml濃度長春新堿作用24h后,P1k1siRNA-251組和

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論