Imatinib對c-Kit陽性多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡相關(guān)機(jī)理研究.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種單克隆漿細(xì)胞惡性增殖性疾病。近年MM的發(fā)病率有上升趨勢，對人們的生命和生存質(zhì)量已經(jīng)構(gòu)成越來越嚴(yán)重的威脅。雖然目前針對MM的治療有多種治療方案，但它仍然是不可治愈的疾病。如何治療難治復(fù)發(fā)MM及提高它們的療效是目前臨床急需解決的問題。 c-Kit是一種Ⅲ型跨膜酪氨酸蛋白激酶受體。已有報(bào)道在MM中惡性漿細(xì)胞而非正常漿細(xì)胞c-Kit有一定比例的表達(dá)，可能可以作為難治復(fù)發(fā)性MM治

2、療的一個(gè)新靶點(diǎn)。Imatinib，是第一個(gè)特異性針對小分子酪氨酸激酶的抑制劑，最早用于治療攜帶：Bcr/Abl融合基因的慢性粒細(xì)胞性白血病和Ph<'+>的急性淋巴細(xì)胞白血病，通過作用于bcr/abl靶點(diǎn)，抑制bcr/abl陽性細(xì)胞的增殖，達(dá)到治療目的。此外，它還可以抑制Arg、Kit和血小板衍化生長因子受體(PDGFR)的活性。其中最為成功的例子是用于治療表達(dá)c-Kit(CD117)的胃腸基質(zhì)細(xì)胞瘤(GISTS)，臨床獲得80﹪以上的緩

3、解。 本課題的設(shè)想： Imatinib可以通過抑制c-Kit受體表達(dá)及相關(guān)信號傳導(dǎo)通路的傳遞抑制腫瘤的發(fā)生，針對c-Kit在多發(fā)性骨髓瘤中有一定比例的表達(dá)，我們擬將格列衛(wèi)用于干預(yù)c-Kit表達(dá)陽性的MM細(xì)胞株，了解Imatinib是否阿康玥抑制c-Kit陽性的MM細(xì)胞株，并進(jìn)一步了解其抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制，為格列衛(wèi)在MM中的臨床應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。二、實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果1．Imatinib可以抑制c-Kit受體傳導(dǎo)通路1

4、.1 Imatinib可以抑制IL-6對c-Kit的促磷酸化作用首先了解MM的一個(gè)重要生長因子IL-6是否可以促進(jìn)c-Kit受體的磷酸化水平。用IL-6刺激無血清培養(yǎng)后的KM3細(xì)胞，用WB法檢測c-Kit的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)IL-6可以促進(jìn)c-Kit的磷酸化。接著了解Imatinib是否可以抑制IL-6對c-Kit的促磷酸化作用，用不同濃度Imatinib處理KM3細(xì)胞4h后，加或不加IL-6，發(fā)現(xiàn)0.1μmol/L的Imatinib可以

5、輕度促進(jìn)c-Kit的磷酸化，10μmol/L的Imatinib可以明顯阻斷IL-6對c-Kit的促磷酸化作用。 1．2 Imatinib可以抑制c-Kit的表達(dá)不同濃度Imatinib作用KM3細(xì)胞24h后，用流式細(xì)胞儀技術(shù)和WB檢測Imatinib對c-Kit受體表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)Imatinib處理后KM3細(xì)胞的c-Kit表達(dá)下調(diào)。 2．Imatinib對KM3細(xì)胞增殖和凋亡的影響2.1 Imatinib可以抑制

6、KM3細(xì)胞的增殖采用XTT比色法檢測。用不同濃度的Imatinib(0.01umol/L-50umol/L)處理KM3細(xì)胞48h后檢測吸光度，發(fā)現(xiàn)濃度小于等于0.1μmol/L時(shí)，Imatinib可以促進(jìn)KM3細(xì)胞增殖(P<0.05)；濃度增大0.25gmol/L或以上，則開始抑制細(xì)胞增殖，呈濃度依賴性。48h的IC 50為0.33μmol/L(P<0.01)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，外源性IL-6不能阻斷Imatinib的抑制增殖作用(P=0

7、.2)。 2.2 Imatinib阻斷KM3細(xì)胞在G0/G1期采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測不同濃度Imatinib處理后KM3細(xì)胞周期分布情況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理后KM3細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期比例減少，提示Imatinib通過阻滯細(xì)胞在GO/G1期抑制細(xì)胞增殖。 2.3 Imatinib可以促進(jìn)KM3細(xì)胞的凋亡用Annexin V/PI FITC雙標(biāo)染色法檢測細(xì)胞早期凋亡，發(fā)現(xiàn)與空白對照相比，用Imatinib處理后KM3細(xì)

8、胞早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞較對照組均明顯增加，隨著濃度的增大，早期凋亡細(xì)胞減少，晚期凋亡細(xì)胞增多，總凋亡率增加。用DNA凝膠電泳法檢測細(xì)胞晚期凋亡，發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理后DNA凝膠電泳出現(xiàn)凋亡的特征性“梯狀”條帶。不同濃度Imatinib處理KM3細(xì)胞24h后，PRO-caspase-3表達(dá)逐漸下降，cleaved caspased-3表達(dá)增加，cleaved PAPP表達(dá)增加。 3．Imatinib對幾條MAPK通路的影響3．1 Ima

9、tinib對ERK1/2通路的影響為了解ERK1/2通路對KM3細(xì)胞的影響，我們采用不同濃度MEK抑制劑PD98059單獨(dú)處理或與Imatinib共同處理KM3細(xì)胞，用XTT法檢測細(xì)胞增殖。結(jié)果PD98059濃度超過50μmol/L時(shí)，可以輕度抑制KM3細(xì)胞增殖(P<0.05)。PD98059與1μmol/L的Imatinib共同作用于KM3細(xì)胞有相加或協(xié)同作用。PD98059單獨(dú)作用對KM3細(xì)胞凋亡沒有明顯影響，與Imatinib共同

10、作用后凋亡率沒有增加。 不同濃度Imatinib作用KM3細(xì)胞，加入或不加IL-6刺激KM3細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1μmol/L的Imatinib可以明顯抑制MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平，減弱外源性IL-6對MEK1/2和ERK1/2的促磷酸化作用，10μmol/L的Imatinib幾乎完全抑制MEK1/2的磷酸化水平，阻斷外源性IL-6的促磷酸化作用。 3．2 Imatinib對p38 MAPK通路的影響0.1μ

11、mol/L的Imatinib可以促進(jìn)p38 MAPK的磷酸化，濃度增加至10μmol/L時(shí)，則可以抑制p38 MAPK的磷酸化。p38 MAPK特異性抑制劑SB203580單獨(dú)處理可以促進(jìn)KM3細(xì)胞增殖，以5mol/L最明顯；SB203580與Imatinib共同作用有明顯拮抗作用，可以拮抗Imatinib的抑增殖和促凋亡作用。 3．3 Imatinib對ERK5通路的影響IL-6可以促進(jìn)ERK5的磷酸化水平。0.1 μmol/

12、L的Imatinib對ERK5的磷酸化水平?jīng)]有明顯影響，也沒有減弱IL-6對KM3的促磷酸化作用；濃度增大至10μmol/L時(shí)，可以明顯抑制ERK5的磷酸化水平，阻斷IL-6對ERK5的促磷酸化作用。用不同濃度Imatinib作用KM3細(xì)胞24h后，ERK5的磷酸化水平和總蛋白表達(dá)均呈濃度依賴性下調(diào)。三、結(jié)論1．Imatinib可以抑制外源性IL-6激活的c-Kit信號傳導(dǎo)通路。 2．Imatinib可以抑制KM3細(xì)胞增殖，促進(jìn)