糖尿病腎病腎小球細胞間相互作用——氧化應激、血小板源性生長因子與系膜細胞.pdf

1、研究目的: 1.建立大鼠原代腎小球系膜細胞的體外培養(yǎng)方法，為體外研究腎小球生物學行為提供細胞模型。 2.觀察高糖對體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞氧化平衡、血小板源性生長因子(PDGF)和核轉錄因子(NF-κB)表達的影響以及茶多酚的干預作用，探討糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的機制以及茶多酚對糖尿病腎病的防治作用。 3.通過系膜細胞和內皮細胞共培養(yǎng)法，證實在高糖條件下兩種細胞問存在異常相互作用和活化內皮細胞對異常相互作用的影響

2、，并這種異常的相互作用對系膜細胞表達PDGF和NF-κB的影響及其在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展中的作用。 研究方法: 1.使用Ⅳ型膠原酶消化法和腎小球分級過篩法分離、培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞，通過形態(tài)學觀察、直接免疫熒光法和免疫細胞化學法鑒定。 2.系膜細胞單獨培養(yǎng)：系膜細胞分別在對照糖濃度(5.5mmol/L)、高糖濃度(25mmol/L)和抗氧化劑茶多酚干預的條件下培養(yǎng)0h、12h、24h、36h、48h，借助紫外分

3、光光度法、免疫細胞化學、RT-PCR和WesternBlotting等方法檢測細胞培養(yǎng)上清液還原型谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性、細胞內血小板源性生長因子-B(PDGF-B)mRNA及蛋白與核轉錄因子(NF-κBp65)蛋白的表達情況。 3.建立系膜細胞與內皮細胞共培養(yǎng)：將內皮細胞預先在正常糖或高糖條件下培養(yǎng)24h，再與系膜細胞共同培養(yǎng)。實驗分為正常對照組、高糖組和茶多酚干預組。采用紫外分光光度法檢測各組上清液中GSH-

4、PX活性，RT-PCR和WesternBlotting技術檢測系膜細胞PDGF-BmRNA及蛋白與NF-κBp65蛋白的表達情況。 研究結果: 1.成功培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞。該細胞呈長梭形或不規(guī)則形，待細胞生長至90％融合即可傳代。傳代后細胞純度極高，生長情況良好。直接免疫熒光染色抗Vimentin陽性、抗CD34陰性，免疫細胞化學染色抗Cytokeratin陰性。 2.系膜細胞單獨培養(yǎng)時，高糖組的GSH-PX

5、活性低于正常對照組；經茶多酚干預后GSH-PX活性增加。與正常對照組相比，高糖可使培養(yǎng)的系膜細胞PDGF-BmRNA和蛋白、NF-κBp65蛋白表達增加，茶多酚則能顯著抑制這一上調作用。 3.經高糖預處理的內皮細胞與系膜細胞共培養(yǎng)時，高糖組上清液GSH-PX活力比正常對照組顯著降低，給予茶多酚后有所提高；高糖亦可增加共同培養(yǎng)的系膜細胞PDGF-BmRNA和蛋白、NF-κBp65蛋白的表達，茶多酚可逆轉高糖的作用。上述現象的改變均

6、比未經高糖預處理的內皮細胞與系膜細胞共同培養(yǎng)更加明顯。 研究結論: 1.通過Ⅳ型膠原酶消化法和腎小球分級過篩法可以培養(yǎng)出大鼠腎小球系膜細胞，在體外細胞生長良好，可傳3～6代。 2.高糖使單獨培養(yǎng)的系膜細胞內抗氧化酶GSH-PX活性下降，引起細胞內氧化失衡，增加促硬化因子PDGF-B的表達，促進腎小球硬化。 3.被高糖活化的內皮細胞能促進共培養(yǎng)的系膜細胞GSH-PX活性下降、PDGF-B表達上調，增強高糖條

7、件下二者的異常相互作用，促進糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。 4.高糖可能通過NF-κB途徑促進系膜細胞PDGF-B表達增加和兩種細胞間的異常相互作用。 5.茶多酚通過減少細胞活性氧(ROS)的產生，調節(jié)細胞氧化平衡和減少促硬化因子表達，抑制NF-κB途徑，保護系膜細胞，干預內皮細胞與系膜細胞的異常相互作用，對延緩糖尿病腎病的進展有一定的作用。 6.與單獨培養(yǎng)系膜細胞相比，系膜細胞與內皮細胞共培養(yǎng)模型能更好地模擬體內的真