糖尿病腎病腎小球細(xì)胞間相互作用——氧化應(yīng)激、血小板源性生長因子與系膜細(xì)胞.pdf

1、研究目的: 1.建立大鼠原代腎小球系膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，為體外研究腎小球生物學(xué)行為提供細(xì)胞模型。 2.觀察高糖對(duì)體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞氧化平衡、血小板源性生長因子(PDGF)和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)表達(dá)的影響以及茶多酚的干預(yù)作用，探討糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制以及茶多酚對(duì)糖尿病腎病的防治作用。 3.通過系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)法，證實(shí)在高糖條件下兩種細(xì)胞問存在異常相互作用和活化內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)異常相互作用的影響

2、，并這種異常的相互作用對(duì)系膜細(xì)胞表達(dá)PDGF和NF-κB的影響及其在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展中的作用。 研究方法: 1.使用Ⅳ型膠原酶消化法和腎小球分級(jí)過篩法分離、培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞，通過形態(tài)學(xué)觀察、直接免疫熒光法和免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定。 2.系膜細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)：系膜細(xì)胞分別在對(duì)照糖濃度(5.5mmol/L)、高糖濃度(25mmol/L)和抗氧化劑茶多酚干預(yù)的條件下培養(yǎng)0h、12h、24h、36h、48h，借助紫外分

3、光光度法、免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR和WesternBlotting等方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液還原型谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性、細(xì)胞內(nèi)血小板源性生長因子-B(PDGF-B)mRNA及蛋白與核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κBp65)蛋白的表達(dá)情況。 3.建立系膜細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)：將內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)先在正常糖或高糖條件下培養(yǎng)24h，再與系膜細(xì)胞共同培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、高糖組和茶多酚干預(yù)組。采用紫外分光光度法檢測各組上清液中GSH-

4、PX活性，RT-PCR和WesternBlotting技術(shù)檢測系膜細(xì)胞PDGF-BmRNA及蛋白與NF-κBp65蛋白的表達(dá)情況。 研究結(jié)果: 1.成功培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞。該細(xì)胞呈長梭形或不規(guī)則形，待細(xì)胞生長至90％融合即可傳代。傳代后細(xì)胞純度極高，生長情況良好。直接免疫熒光染色抗Vimentin陽性、抗CD34陰性，免疫細(xì)胞化學(xué)染色抗Cytokeratin陰性。 2.系膜細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，高糖組的GSH-PX

5、活性低于正常對(duì)照組；經(jīng)茶多酚干預(yù)后GSH-PX活性增加。與正常對(duì)照組相比，高糖可使培養(yǎng)的系膜細(xì)胞PDGF-BmRNA和蛋白、NF-κBp65蛋白表達(dá)增加，茶多酚則能顯著抑制這一上調(diào)作用。 3.經(jīng)高糖預(yù)處理的內(nèi)皮細(xì)胞與系膜細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，高糖組上清液GSH-PX活力比正常對(duì)照組顯著降低，給予茶多酚后有所提高；高糖亦可增加共同培養(yǎng)的系膜細(xì)胞PDGF-BmRNA和蛋白、NF-κBp65蛋白的表達(dá)，茶多酚可逆轉(zhuǎn)高糖的作用。上述現(xiàn)象的改變均

6、比未經(jīng)高糖預(yù)處理的內(nèi)皮細(xì)胞與系膜細(xì)胞共同培養(yǎng)更加明顯。 研究結(jié)論: 1.通過Ⅳ型膠原酶消化法和腎小球分級(jí)過篩法可以培養(yǎng)出大鼠腎小球系膜細(xì)胞，在體外細(xì)胞生長良好，可傳3～6代。 2.高糖使單獨(dú)培養(yǎng)的系膜細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶GSH-PX活性下降，引起細(xì)胞內(nèi)氧化失衡，增加促硬化因子PDGF-B的表達(dá)，促進(jìn)腎小球硬化。 3.被高糖活化的內(nèi)皮細(xì)胞能促進(jìn)共培養(yǎng)的系膜細(xì)胞GSH-PX活性下降、PDGF-B表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)高糖條

7、件下二者的異常相互作用，促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。 4.高糖可能通過NF-κB途徑促進(jìn)系膜細(xì)胞PDGF-B表達(dá)增加和兩種細(xì)胞間的異常相互作用。 5.茶多酚通過減少細(xì)胞活性氧(ROS)的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化平衡和減少促硬化因子表達(dá)，抑制NF-κB途徑，保護(hù)系膜細(xì)胞，干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞與系膜細(xì)胞的異常相互作用，對(duì)延緩糖尿病腎病的進(jìn)展有一定的作用。 6.與單獨(dú)培養(yǎng)系膜細(xì)胞相比，系膜細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型能更好地模擬體內(nèi)的真