神經(jīng)膠質源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和白細胞介素-1α促進大鼠骨髓基質細胞誘導分化為多巴胺能神經(jīng)元的實驗研究.pdf

1、研究背景 帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)是一種中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，帕金森病的病理改變主要在黑質、紋狀體(尾核和殼核)，其最大特點是病變只侵犯單一類型的神經(jīng)元多巴胺能神經(jīng)元，造成中腦黑質致密部多巴胺能神經(jīng)元選擇性地死亡、缺失，致紋狀體多巴胺不足，紋狀體和黑質部位多巴胺含量顯著減少；多巴胺能神經(jīng)元主要分布在紋狀體、中腦腹側被蓋區(qū)及黑質等腦區(qū)，形成腦內(nèi)兩個多巴胺能環(huán)路。一個為從黑質到紋狀體尾殼核的投

2、射；另一個為中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)；前者在錐體外系控制運動方面起關鍵作用，后者則是參與獎賞效應的重要作用系統(tǒng)。一些疾病如：帕金森病，精神分裂癥，Tourette綜合征，注意力缺陷多動綜合征等都與多巴胺遞質傳遞障礙有關。帕金森病導致基底節(jié)神經(jīng)調節(jié)功能的紊亂，使多巴胺信號傳送功能及控制運動的作用出現(xiàn)紊亂，從而引起一系列癥狀。帕金森病單一類型的多巴胺能神經(jīng)元的病理改變，為多巴胺能神經(jīng)細胞的替代治療提供了病理基礎，目前藥物治療存在諸多缺陷，基因治療

3、雖然前途光明卻路途遙遠，使得多巴胺能神經(jīng)元的替代治療變得緊迫。胚胎源性神經(jīng)干細胞的有限來源及倫理道德問題給體外得到大量可應用的非胚胎源性神經(jīng)干細胞及多巴胺能神經(jīng)元提出了必然要求，國內(nèi)外相關的理論和實驗研究報道為骨髓源性的多巴胺能神經(jīng)元的移植治療提供了理論基礎；骨髓基質細胞(BMSCs)可以從自身獲得，無免疫排斥，無倫理道德問題，來源豐富，骨髓源性多巴胺能神經(jīng)元是解決這一問題的有效途徑，具有廣闊的發(fā)展前景。 多巴胺能神經(jīng)元是指主要

4、以酪氨酸羥化酶(TH)陽性細胞及多巴胺轉運體(DAT)等其他表型標志物為特征的神經(jīng)元。多巴胺受體也是其特征性表型標志物之一，酪氨酸羥化酶是合成多巴胺等兒茶酚胺類神經(jīng)遞質裁的限速酶，它和多巴脫羥酶一起構成鑒別多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)的標志酶，用酪氨酸羥化酶及多巴胺轉運體的抗血清檢測多巴胺能神經(jīng)元及纖維在大鼠腦的分布是經(jīng)常采用的方法，還可以用針對多巴胺的抗體和多巴胺受體的抗體，來檢測腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元及纖維的分布。 多巴胺受體可分為多巴胺D

5、1樣受體和多巴胺D2樣受體；其中多巴胺D1樣受體又可分為多巴胺D1受體和多巴胺D5受體兩種亞型；多巴胺D2樣受體又可分為多巴胺D2、D3和D4受體三種亞型。多巴胺受體D2(DRD2)含415個氨基酸殘基，是一種糖蛋白，分為長型(D2L)和短型(D2s)兩種，D2L比D2s多29個氨基酸。DRD2主要位于蒼白球、丘腦核團、基底節(jié)。在皮層中DRD2主要分布于海馬結構及顳葉內(nèi)側腦區(qū)。DRD2在新皮層中分布是多相性的，在大部分腦區(qū)中，DRD2定

6、位于表淺的皮層，在枕部皮層定位較深。D2受體存在于紋狀體中等多棘神經(jīng)元，在棘突和棘頭的分布比胞體密集。D2免疫反應終端形成的對稱性突觸多于非對稱性突觸。D2受體存在于黑質致密部的核周體和樹突，和其他紋狀體投射相比，更集中于蒼白球外段。D2受體免疫陽性反應還可在嗅球的顆粒層和內(nèi)從層以及杏仁核見到其特殊的中樞分布，多巴胺D2受體與D1是兩種最經(jīng)典的亞型，是構成紋狀體多巴胺能神經(jīng)直接和間接通路的主要受體。D2屬于7次跨膜受體超家族，與G蛋白耦

7、聯(lián)抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，D2受體的激活還可能誘導即早基因及細胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，是與帕金森病有關的最重要的多巴胺受體亞型之一。多巴胺通過DRD2mRNA表達的產(chǎn)物受體的介導，調節(jié)著與這些腦區(qū)相關的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種功能及精神活動：感知、情感行為和運動。 細胞因子可以在體內(nèi)外誘導出多巴胺能神經(jīng)元。IL-1在多種因子中誘導中腦神經(jīng)前體細胞分化為酪氨酸羥化酶陽性神經(jīng)元的作用最強，聯(lián)合應用IL-1、IL-11、GDNF和LIF時，

8、多巴胺能神經(jīng)元不僅在數(shù)量上進一步增加，而且隨時間延長逐漸出現(xiàn)較長的突起結構，形態(tài)上類似于腦內(nèi)的多巴胺能神經(jīng)元，Zao應用18種細胞因子在各種組合的條件下對大鼠胚胎的中腦細胞進行了誘導研究，在受試的所有細胞因子中僅有白細胞介素-1(IL-1)α和β能夠誘導酪氨酸羥化酶陽性表達，bFGF除了促有絲分裂的作用之外，不具有誘導多巴胺能神經(jīng)元的作用。 目前國內(nèi)外以胚胎研究為主，尚無骨髓基質細胞向多巴胺神經(jīng)元轉化的研究報道，關于神經(jīng)干細胞體

9、外誘導表達多巴胺能神經(jīng)元特有的酪氨酸羥化酶及多巴胺轉運體的研究很多，但對多巴胺受體的表達卻研究很少。而遞質與受體是神經(jīng)系統(tǒng)功能的不可分割的兩個方面.本實驗用抗多巴胺受體D2L來檢測多巴胺能神經(jīng)元，為多巴胺能神經(jīng)元替代治療帕金森病開辟新的途徑。 第一章大鼠骨髓基質細胞誘導分化為神經(jīng)干細胞 目的 熟悉并掌握大鼠骨髓基質細胞體外培養(yǎng)的形態(tài)特征；探討大鼠骨髓基質細胞誘導分化為神經(jīng)干細胞的分化規(guī)律；檢測神經(jīng)干細胞標記物Ne

10、stin；為后續(xù)實驗奠定基礎。 方法 健康雄性SD大鼠(Sprague-Dawleyrats)12只，體重180～220克，隨機分為2組：實驗組(n=6)。2、對照組(n=6)。實驗組為5％FBS+神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基，對照組為5％FBS，其他條件均相同；實驗按照隨機、重復，對照三大原則進行。之后采用離心法從骨髓中分離培養(yǎng)基質細胞：以成年斯普拉-道來(氏)大鼠(Sprague-Dawley：SD)雄性大鼠骨髓基質細胞(BMS

11、Cs)為實驗對象，利用神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基和5％FBS進行增殖培養(yǎng)、分化誘導；用SABC免疫細胞化學方從第6天開始行神經(jīng)巢蛋白(nestin)檢測。用PBS替代第一抗體做空白對照。DAB顯色，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS日本)觀察、照相，存檔。 結果 SD大鼠股骨中分離出的骨髓基質細胞接種培養(yǎng)后0h大圓者為骨髓基質細胞，5h后有兩大類，一為呈圓盤狀的紅細胞；另一類是數(shù)量較多胞體較大的大圓細胞，半懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)5d后，

12、為量少而大的細胞球和大圓細胞；大細胞球由許多小細胞組成，免疫細胞化學鑒定與周圍的大圓細胞同性，表達nestin。10d后出現(xiàn)大克隆球形態(tài)，主要由大圓細胞組成，背景為雜細胞其形態(tài)各異。培養(yǎng)15d，胞體呈長梭形，有兩個或多個突起，并有突起相互連接。用Nestin檢測免疫細胞化學鑒定出神經(jīng)干細胞。骨髓基質細胞的分化規(guī)律：細胞培養(yǎng)6d時開始出現(xiàn)nestin陽性細胞，為3.8％，培養(yǎng)第15d的細胞呈典型nestin強陽性反應，陽性率為22.3％，

13、達到高峰，隨后下降，30d時nestin陽性細胞為5.8％。 結論 骨髓基質細胞懸浮于神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中并滴加5％胎牛血清，可以誘導增殖分化為神經(jīng)干細胞。6d時開始出現(xiàn)nestin陽性細胞，15d的細胞呈典型nestin強陽性反應達到高峰，隨后下降，30d時nestin為弱陽性，形態(tài)為神經(jīng)元樣細胞，有突起。 第二章大鼠骨髓基質細胞向多巴胺能神經(jīng)元的誘導分化 目的 探索骨髓基質源性神經(jīng)干細胞誘導分化

14、為多巴胺能神經(jīng)元的分化條件和發(fā)生機制，比較不同血清濃度、不同IL-1α(白介素-1)及不同GDNF(膠質細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子)濃度等誘導條件下骨髓基質細胞分化情況；為BMSCs在神經(jīng)科學領域內(nèi)的應用奠定基礎。 方法 40只SD大鼠(Sprague-Dawley，SD)雄性大鼠，按照隨機、重復、對照原則共分為五組，每組8只。血清組：10％的胎牛血清；GDNF組：10ng/mlGDNF+10％的胎牛血清+神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基。IL

15、-1α組：100pg/mlIL-1α+10％的胎牛血清+神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基。GDNF+IL-1α組：10ng/mlGDNF+100pg/mlIL-1α+10％的胎牛血清+神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基。對照組：10％的胎牛血清+神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基。以成年SD大鼠雄性大鼠骨髓基質細胞(BMSCs)為實驗對象，利用白介素-1α(IL-1α)、膠質細胞系來源神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)等作為增殖及分化誘導因子，進行增殖培養(yǎng)、分化誘導；用SABC免疫細胞化學方法及間

16、接免疫熒光法進行細胞鑒定。 結果 加入GDNF、IL-1α三周測出DA受體D2檢測陽性，GDNF組及IL-1α組的分化率均較對照組及血清組升高(P＜0.05)，GDNF+IL-1α組與GDNF組及IL-1α組比較分化率更加顯著(P＜0.05)，GDNF及IL-1α聯(lián)合誘導分化組間比較P＜0.01，組內(nèi)與血清組，對照組比較P＜0.05。GDNF及IL-1α聯(lián)合誘導分化骨髓基質細胞(BMSCs)為多巴胺神經(jīng)元的分化率為12％